軟骨細(xì)胞通過產(chǎn)生軟骨,在骨折愈合中發(fā)揮重要作用。軟骨的形成穩(wěn)定了骨折斷端并形成骨痂,從而促進(jìn)了軟骨內(nèi)成骨。同時(shí),軟骨細(xì)胞產(chǎn)生的各種生長因子在骨折的愈合過程中發(fā)揮重要作用。血管化對(duì)于骨折的修復(fù)及正常愈合是至關(guān)重要的。當(dāng)血管化被抑制時(shí)會(huì)嚴(yán)重影響骨折修復(fù)過程并導(dǎo)致愈合不良,良好的血管化是骨折愈合的保證。本研究探討了軟骨細(xì)胞在骨折愈合過程中對(duì)血管化的影響以及在這一過程中轉(zhuǎn)錄因子Fox O1發(fā)揮的作用。實(shí)驗(yàn)首先利用軟骨細(xì)胞內(nèi)Fox O1基因敲除小鼠骨折模型,采用Micro CT,Western blot及免疫熒光法（Immunofluorescence,IF）驗(yàn)證了模型的成功建立并探討軟骨細(xì)胞內(nèi)Fox O1敲除對(duì)小鼠骨折愈合的影響。隨后采用q RT-PCR和IF檢測(cè)血管化標(biāo)志物CD31及血管內(nèi)皮生長因子（VEGFA）的表達(dá)變化,闡述Fox O1基因?qū)浌莾?nèi)新生血管的影響。最后,在體外實(shí)驗(yàn)中通過利用染色質(zhì)免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation,Ch IP）技術(shù)及雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)（Luciferase Reporter Assay）,探討軟骨細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子Fox O... 

【文章來源】：吉林大學(xué)吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：91 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

FOXO1結(jié)構(gòu)與翻譯后修飾[130]

3.1 體內(nèi)驗(yàn)證軟骨細(xì)胞內(nèi) FoxO1 敲除對(duì)骨折愈合及血管生成的影響3.1.1 驗(yàn)證條件性基因敲除小鼠骨折模型的構(gòu)建3.1.1.1 小鼠基因型的驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)利用 Col2 1Cre 重組酶對(duì)軟骨細(xì)胞內(nèi) FoxO1 進(jìn)行敲除。有文獻(xiàn)證實(shí)Col2 1Cre 轉(zhuǎn)基因模型可以特異性地刪除軟骨細(xì)胞中的幾個(gè)固定基因，但不影響其他細(xì)胞中該基因的表達(dá)[48]。利用基因型檢測(cè)對(duì)小鼠條件性基因敲除進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果結(jié)果如圖 3.1 所示，在 Col2 1Cre+實(shí)驗(yàn)組和匹配的 Col2 1Cre-對(duì)照小鼠中均檢測(cè)到具有側(cè)翼 loxP 位點(diǎn)（149bp）的 FoxO1 存在，而僅在具有 Cre 重組酶的小鼠中檢測(cè)到了經(jīng)剪切斷裂的 FoxO（1198bp）。Cre重組酶擴(kuò)增子（352bp在 Col2 1Cre+實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)而 Col2 1Cre-對(duì)照組小鼠中沒有表達(dá)。

吉林大學(xué)博士學(xué)位論文3.1.1.2 免疫熒光法驗(yàn)證軟骨內(nèi) FoxO1 敲除進(jìn)一步對(duì)Col2 1Cre+實(shí)驗(yàn)組小鼠和Col2 1Cre-對(duì)照組小鼠股骨骨折標(biāo)本進(jìn)行組織學(xué)番紅快綠染色及 FoxO1 免疫熒光檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖 3.2 所示，番紅快綠組織學(xué)染色可以清晰的辨別骨折樣本中的骨組織與軟骨組織，其中軟骨被染色成紅色而骨組織被染色為綠色，由此可以確定該樣本中軟骨與骨組織的邊界，確保免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確。免疫熒光結(jié)果顯示；在 Col2 1Cre-對(duì)照組（WT）小鼠中，F(xiàn)oxO1 在骨組織及軟骨組織內(nèi)均有表達(dá)；而在 Col2 1Cre+實(shí)驗(yàn)組（FoxO1 KO）小鼠中，F(xiàn)oxO1 表達(dá)僅限于骨組織內(nèi)，而在軟骨組織內(nèi)沒有表達(dá)。該結(jié)果驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)組小鼠軟骨內(nèi) FoxO1 的特異性敲除。


本文編號(hào)：3275162