目的運用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù),在人惡性橫紋肌樣瘤細胞株G401中敲除p21基因。方法通過反轉(zhuǎn)錄定量PCR（RT-q PCR）及Western blot檢測各瘤細胞株中p21的表達,針對p21基因作用的功能域,設計了靶向人p21基因第3個外顯子的向?qū)NA（sg RNA）,克隆入lenti CRISPR v2載體。將測序及酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒在293T工具細胞中制備慢病毒顆粒并感染G401細胞,使用嘌呤霉素進行陽性細胞篩選,顯微鏡下挑取單克隆細胞團并繼續(xù)培養(yǎng)獲得G401單克隆細胞株。提取單克隆細胞株RNA及蛋白,利用RT-q PCR及Western blot方法檢測細胞株中p21的敲除效果。結(jié)果 p21在人橫紋肌樣瘤細胞中高表達。成功構(gòu)建靶向p21基因的lenti CRISPRv2-sg RNA重組慢病毒質(zhì)粒。與對照組相比,篩選得到的G401亞克隆細胞系中p21蛋白表達缺失。結(jié)論針對難轉(zhuǎn)染的G401細胞,應用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功構(gòu)建了p21基因敲除的穩(wěn)定株,為后續(xù)深入研究p21在人惡性橫紋肌樣瘤中的作用機制奠定了基礎。 

【文章來源】：天津醫(yī)藥. 2016,44(10)

【文章頁數(shù)】：5 頁

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1實驗材料
        1.1.1質(zhì)粒、菌株及細胞
        1.1.2酶類及主要試劑
        1.1.3其他
    1.2方法
        1.2.1 sg RNA oligo序列的設計
        1.2.2 lenti CRISPR v2-p21的構(gòu)建與鑒定
        1.2.3病毒包裝、細胞感染及單克隆細胞的獲得
        1.2.4 Western blot及反轉(zhuǎn)錄定量PCR（RT-q PCR）檢測p21的表達
    1.3統(tǒng)計學方法
2 結(jié)果
    2.1 p21在人MRT細胞中的表達
    2.2 sg RNA靶點的選擇及寡核苷酸序列
    2.3 重組質(zhì)粒lenti CRISPR v2-p21的測序及酶切
    2.4 Western blot及RT-q PCR檢測p21基因敲除的效果
3 討論
    3.1 p21在腫瘤中的雙重作用
    3.2 CRISPR/Cas9慢病毒系統(tǒng)


【參考文獻】：
期刊論文
[1]Oncogenic role of p21 in hepatocarcinogenesis suggests a new treatment strategy[J]. Shogo Ohkoshi,Masahiko Yano,Yasunobu Matsuda.  World Journal of Gastroenterology. 2015(42)
[2]利用CRISPR/Cas9n系統(tǒng)構(gòu)建Asxl2基因敲除的NIH3T3穩(wěn)定細胞系[J]. 方佳萍,趙秀娟,齊艷,王璽,吳旭東,婁建石.  天津醫(yī)藥. 2015(10)



本文編號：2991423