第一部分缺氧對大鼠生長板軟骨細胞軟骨表型的影響目的:研究缺氧刺激對大鼠生長板軟骨細胞軟骨表型的影響方法:1.分離獲得大鼠生長板軟骨細胞,并利用1%氧濃度刺激大鼠生長板軟骨細胞。2.利用CCK-8（Cell Counting Kit-8,細胞計數試劑盒-8）法檢測1%氧濃度缺氧刺激對生長板軟骨細胞增殖的影響。3.利用RT-PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,逆轉錄-聚合酶鏈反應）檢測時間梯度下1%氧濃度缺氧刺激后生長板軟骨細胞中SOX9（sexdetermining region Y-type high mobility group box protein 9,性別決定區(qū)Y型高遷移率族蛋白9）、CollagenⅡ（Ⅱ型膠原）和Aggrecan（聚集蛋白聚糖）基因水平表達的影響。4.利用Western blotting（免疫印跡實驗）和免疫熒光的方法檢測時間梯度下1%氧濃度缺氧刺激后生長板軟骨細胞SOX9、CollagenⅡ和Aggrecan蛋白水平表達變化。結果:1.缺氧對生長板軟骨細胞生長曲線并無明顯影響。2.缺氧能夠... 

【文章來源】：華中科技大學湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學位級別】：博士

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生長板軟骨細胞增殖曲線。在常氧條件(21%O2)和缺氧(1%O2)培養(yǎng)1天、2天和3天,CCK-8細胞增殖實驗檢測軟骨細胞生長曲線。數據表示為平均值±標準偏差(n=3)。

為了研究缺氧對生長板軟骨細胞軟骨特異性標記物基因水平表達的影響,我們利用RT-PCR的方法檢測SOX9、CollagenⅡ和Aggrecan在內的軟骨特異性標記物的基因水平表達情況。如圖所示,RT-PCR結果顯示缺氧促進SOX9、CollagenⅡ和Aggrecan基因水平的表達,并且SOX9和Aggrecan的基因水平表達在缺氧刺激4小時時候達到峰值。在缺氧(1%O2)培養(yǎng)0,2,4和8小時的軟骨細胞中SOX9、CollagenⅡ和Aggrecan的mRNA表達。數據表示為平均值±標準偏差(n=3)并歸一化至對照組(0小時)。與對照組(0小時)相比,*P<0.05,**P<0.01和***P<0.001。

為了研究缺氧對生長板軟骨細胞SOX9、CollagenⅡ和Aggrecan蛋白水平的表達的影響,我們利用Western blotting和免疫熒光的方法檢測SOX9、CollagenⅡ和Aggrecan蛋白水平表達情況。如圖2A所示SOX9、CollagenⅡ和Aggrecan的蛋白表達水平在軟骨細胞缺氧反應中顯著增加。值得注意的是,當軟骨細胞在缺氧條件下干預達8小時后,SOX9、CollagenⅡ和Aggrecan的蛋白表達水平與干預4小時相比有所下調,但SOX9和CollagenⅡ的表達水平與對照組相比是有所增加(圖2A和B)。然后通過免疫熒光研究SOX9和CollagenⅡ的表達水平,與蛋白質和基因表達結果一致,通過暴露于缺氧條件下4小時,軟骨細胞中的SOX9和CollagenⅡ沉積顯著增加(圖2C和D)。這些結果表明,缺氧誘導軟骨細胞特異性標記物在軟骨細胞中的表達,從而促進軟骨形成表型的維持。結論


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