第一部分:雌激素影響MC3T3-E1細胞的增殖和凋亡目的:本研究用不同濃度的β-雌二醇處理MC3T3-E1細胞,研究雌激素對成骨細胞分化的作用機制,并獲得合適的處理濃度來進行下一步的RNA深度測序實驗。方法:用不同濃度的β-雌二醇處理小鼠成骨MC3T3-E1細胞,DMSO為對照組,觀察各組細胞的形態(tài)變化,然后利用CCK-8試劑盒來檢測細胞的增殖情況,并且利用TUNEL試劑盒檢測不同濃度下MC3T3-E1細胞的凋亡情況。結果:在低濃度(0.01n M和0.1n M)β-雌二醇的處理組中,細胞的形態(tài)、細胞的增殖和細胞的凋亡等細胞行為方面相對于DMSO對照組均未產生明顯的差異;在1n M和10n M高濃度β-雌二醇處理組中,細胞的形態(tài)在顯微鏡下觀察沒有明顯的差異,但是在細胞的凋亡和細胞的增殖方面卻出現(xiàn)了顯著的差異,尤其在10n M處理組出現(xiàn)了極其顯著的差異。結論:10n Mβ-雌二醇為引起MC3T3-E1成骨細胞分化的最適濃度。本研究將選擇10n M的處理濃度來進行下一步RNA深度測序,進一步闡述雌激素作用于成骨細胞的內在機制。第二部分RNA深度測序分析雌激素作用成骨細胞的基因和信號通路目的:為了更加深入地研究雌性激素對成骨細胞的作用機制,內在的靶向基因和信號通路,本研究利用雌激素處理小鼠MC3T3-E1細胞并進行RNA深度測序,為深入闡述雌激素作用成骨細胞的內在作用機制提供可能。方法:利用10n Mβ-雌二醇處理小鼠MC3T3-E1細胞,3天后收集處理細胞和對照組細胞并進行RNA提取,構建兩個轉錄組庫,進行RNA測序分析,將處理結果進行生物信息分析。結果:相對于對照組,本研究在處理組中發(fā)現(xiàn)460個差異表達基因,在這些差異表達基因中,上調的基因有66個,下調的基因有394個。利用這些差異表達基因,本研究進行GO分類和pathway分析,發(fā)現(xiàn)許多骨代謝相關的生物過程和細胞信號通路紊亂。這些被富集的骨代謝相關的信號通路包括經典的TGF-β信號通路,Wnt信號通路和MAPK信號通路。其中,在TGF-β信號通路中,Tgfbr1和Bmpr1a兩個關鍵基因的表達明顯地被抑制。結論:雌激素影響了成骨細胞內骨代謝基因表達和骨代謝相關的信號通路。第三部分雌激素作用于骨代謝關鍵基因的分子機制研究目的:在深度測序的差異表達基因中發(fā)現(xiàn)Tgfbr1和Bmpr1a兩個基因的表達明顯被抑制。本部分深入研究雌激素抑制Tgfbr1和Bmpr1a兩個基因的分子作用機制。方法:首先利用qRT-PCR驗證差異表達的基因,然后利用雌激素受體抑制劑分別處理MC3T3-E1細胞,檢測Tgfbr1和Bmpr1a兩個基因的表達。啟動子分析軟件發(fā)現(xiàn)Tgfbr1和Bmpr1a基因的啟動子,存在有雌激素受體應答原件,最后Ch IP實驗驗證雌激素受體β對Tgfbr1和Bmpr1a啟動子的綁定作用。結果:雌激素受體β參與了雌激素對Tgfbr1和Bmpr1a基因的抑制性作用,生物信息學分析發(fā)現(xiàn),在Tgfbr1的啟動子區(qū)域存在3個雌激素受體應答原件,在Bmpr1a的啟動子區(qū)域有2個雌激素受體應答原件。Ch IP實驗證明,雌激素能夠增強雌激素受體β對Tgfbr1和Bmpr1a基因的綁定性作用。結論:雌激素通過雌激素受體β抑制Tgfbr1和Bmpr1a基因的表達。
【學位單位】：蘇州大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R68
【部分圖文】：

1 不同濃度的 β-雌二醇處理后 MC3T3-E1 細胞的形態(tài)觀察（單位：不同濃度的 β-雌二醇對 MC3T3-E1 細胞細胞增殖實驗的檢測濃度的β-雌二醇處理MC3T3-E1細胞24小時后利用CCK-8來檢測果顯示：低濃度（0.01 和 0.1nM）處理組 MC3T3-E1 細胞的增殖相對有出現(xiàn)明顯的差別(p>0.05)；在高濃度處理組（1 和 10nM）處理組 M殖相對于 DMSO 處理組分別出現(xiàn)了顯著性(p<0.05)和極其顯著性(異（圖 1-2）。這些結果說明了高濃度的處理組明顯地增加了 MC3。

同濃度的 β-雌二醇處理后 MC3T3-E1 細胞的形態(tài)觀察（單濃度的 β-雌二醇對 MC3T3-E1 細胞細胞增殖實驗的檢測度的β-雌二醇處理MC3T3-E1細胞24小時后利用CCK-8來檢示：低濃度（0.01 和 0.1nM）處理組 MC3T3-E1 細胞的增殖相出現(xiàn)明顯的差別(p>0.05)；在高濃度處理組（1 和 10nM）處理相對于 DMSO 處理組分別出現(xiàn)了顯著性(p<0.05)和極其顯著（圖 1-2）。這些結果說明了高濃度的處理組明顯地增加了 M

利用 TUNEL 染色實驗檢測不同濃度的 β-雌二醇對 MC3T3-E1 細胞凋單位：nM據(jù)細胞的染色，本研究對選擇區(qū)域內凋亡的細胞分別記數(shù)，然后統(tǒng)計分示（圖 1-4）。 根據(jù)統(tǒng)計結果本研究能夠得出，在低濃度的處理組（β-雌二醇對 MC3T3-E1 細胞的凋亡相對于 DMSO 對照組沒有明顯)；在高濃度處理組（1 和 10nM），雌激素對 MC3T3-E1 細胞的凋亡相對于產生的凋亡數(shù)目明顯的增多，尤其是在 10nM 處理組，出現(xiàn)了極其顯著0.01）（圖 1-4）。
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本文編號：2883179