隨著生活水平的提高,國人參加體育鍛煉和競賽的活動明顯增加,隨之導(dǎo)致的運(yùn)動損傷也逐年增多。肌腱損傷是人體運(yùn)動損傷的常見疾病,其中肩袖等部位的肌腱損傷是目前臨床上治療的難點(diǎn)。根據(jù)患者術(shù)后隨訪及影像學(xué)檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn),修補(bǔ)或重建的肩袖大多數(shù)難以達(dá)到足夠的力學(xué)強(qiáng)度,相當(dāng)一部分患者存在肩袖修補(bǔ)失敗和再次斷裂的情況。肩袖損傷修復(fù)困難的原因是多方面的,其中最主要的原因是很難達(dá)到理想的腱骨愈合。腱骨愈合是決定肌腱損傷修復(fù)成功與否的關(guān)鍵。生理上的腱骨連接點(diǎn)分為間接止點(diǎn)與直接止點(diǎn)兩類。間接止點(diǎn)通過較厚的韌帶組織固定在骨膜上,其特征為穿插性的膠原纖維連接,這種纖維的走向通常與骨縱軸成角或垂直,稱為sharpey纖維。直接止點(diǎn)則通過一漸變轉(zhuǎn)化區(qū)域逐漸將肌腱錨定在骨深層,這一結(jié)構(gòu)可分為四層,包括韌帶組織,纖維軟骨組織,鈣化軟骨組織及骨組織。肌腱損傷后修復(fù)重建形成直接止點(diǎn)需要一個(gè)漫長過程,可達(dá)數(shù)月至數(shù)年。這一修復(fù)過程因時(shí)間漫長,機(jī)制復(fù)雜往往難以順利完成。目前,臨床上大多應(yīng)用自體或異體肌腱移植重建來修復(fù)肌腱損傷,肌腱移植物植入骨隧道后需經(jīng)歷壞死期、增殖期和韌帶化期才能達(dá)到比較理想的腱骨愈合。壞死期亦稱為炎癥期,該過程中肌腱移植物出現(xiàn)壞死降解,其力學(xué)強(qiáng)度將顯著降低,一般指移植物植入后4周內(nèi)。增殖期肌腱移植物出現(xiàn)重塑及再血管化,在此期間移植物內(nèi)細(xì)胞的數(shù)量及活性決定細(xì)胞外基質(zhì)的含量及血管化程度,通常指移植物植入后4-12周。韌帶化期指增殖期后至移植物重建形成理想腱骨愈合界面的漫長階段,可根據(jù)具體情況長達(dá)數(shù)月至數(shù)年。在上述過程中,增殖期是腱骨愈合修復(fù)的關(guān)鍵,肌腱移植物能否在這一時(shí)期內(nèi)及時(shí)重塑及充分血管化很大程度上決定了韌帶化期能否達(dá)到理想的腱骨愈合。然而,目前臨床上廣泛應(yīng)用的自體或異體肌腱內(nèi)部組織致密,間隙狹小,難以滿足早期細(xì)胞快速長入的需求。肌腱移植物在壞死期過后往往因細(xì)胞含量不足很難進(jìn)行及時(shí)有效地增殖重塑和血管化,從而導(dǎo)致腱骨愈合后期修復(fù)延遲甚至失敗。近年來,應(yīng)用組織工程技術(shù)修復(fù)腱骨愈合逐漸成為研究熱點(diǎn)。鑒于人體肌腱韌帶組織需要承受關(guān)節(jié)運(yùn)動時(shí)強(qiáng)大的負(fù)荷,在肌腱損傷的組織工程中,我們需要通過置入支架材料來滿足損傷肌腱早期康復(fù)鍛煉所需的力學(xué)強(qiáng)度,并通過有效募集、粘附周圍組織細(xì)胞,促進(jìn)其長入、增殖并產(chǎn)生細(xì)胞生長因子來加速損傷肌腱的再生。蠶絲作為一種生物相容性好,力學(xué)性能強(qiáng)和降解緩慢的纖維蛋白,在肌腱、韌帶組織工程中的應(yīng)用日益深入。Altman、Sahoo等研究了蠶絲支架用于肌腱重建,發(fā)現(xiàn)其力學(xué)強(qiáng)度可靠,能獲得較好的前中期效果。但他們同時(shí)發(fā)現(xiàn),蠶絲支架內(nèi)部孔隙很小,阻礙了新生組織的長入,后期不能在支架內(nèi)形成相互連接、有功能的修復(fù)組織。把蠶絲進(jìn)行一定程度的編織可有效增加內(nèi)部的孔隙,但編織蠶絲在承擔(dān)較大拉力時(shí)其內(nèi)部孔隙會大大減小。最近,本研究成員把編織狀的蠶絲和膠原海綿復(fù)合,構(gòu)建出了一個(gè)較單純蠶絲支架更加實(shí)用的肌腱、韌帶組織工程支架。其中,膠原海綿可提供修復(fù)周圍組織細(xì)胞粘附和長入的必要空間,編織狀蠶絲纖維可提供足夠的力學(xué)強(qiáng)度。此支架在一些肌腱、韌帶損傷的修復(fù)中改善了修復(fù)組織的結(jié)構(gòu)和功能,表現(xiàn)出了良好的效果。然而,由于肌腱止點(diǎn)腱骨界面特殊的分層結(jié)構(gòu),我們認(rèn)為該膠原-蠶絲支架的空間拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)對腱骨愈合的修復(fù)效果影響甚大。目前,國內(nèi)外尚無相關(guān)報(bào)道�；谏鲜銮闆r,本研究分別制作了平行、紊亂兩種不同空間拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的膠原支架及膠原-蠶絲復(fù)合支架,通過體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)研究它們對腱骨愈合修復(fù)的影響,為該支架應(yīng)用于臨床提供理論依據(jù)。我們的研究主要分成三個(gè)部分,分別為:(1)支架的制作、檢測,新西蘭兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(RBMSCs)的培養(yǎng)、鑒定和三系分化;(2)比較平行及紊亂的膠原支架對RBMSCs細(xì)胞形態(tài)、增殖、遷移的影響及成腱、成骨表達(dá)的作用;(3)比較平行及紊亂的膠原-蠶絲支架對家兔肩袖腱骨愈合的修復(fù)作用。第一部分支架的制作、檢測,新西蘭兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(RBMSCs)的培養(yǎng)、鑒定和三系分化目的:制作膠原支架、膠原-蠶絲支架,檢測其孔隙、力學(xué)等基本特性;原代提取、培養(yǎng)RBMSCs,流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞表型,三系分化評估其干細(xì)胞潛能。方法:在無菌條件下剝?nèi)∝i腿肌腱,沖洗之后用蛋白酶酶解,充分酶解后通過離心、過濾、鹽析、再離心、醋酸溶解、膠原透析等步驟獲取單純的膠原。編織蠶絲購自Zhejiang Cathaya International Co.Ltd公司。將1%(w/v)膠原溶液置于亞克力模具中,利用液氮作為凍源,通過常規(guī)、單向冰凍技術(shù)獲得平行、紊亂膠原半成品,再通過凍干、熱交聯(lián)等一系列步驟即獲得平行、紊亂的膠原支架。冰凍前事先將編織蠶絲置于膠原溶液中,類似方法操作可獲得平行、紊亂的膠原-蠶絲支架。大體、鏡下觀察支架形態(tài),制作不同膠原含量的支架(6mg/ml、10mg/ml、18mg/ml膠原濃度)。掃描電鏡評估支架內(nèi)部孔隙大小。將支架植入家兔皮下2周后,評估支架內(nèi)部孔隙塌陷及細(xì)胞長入情況,從而獲得最適合細(xì)胞長入且支架空間拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定的膠原濃度。力學(xué)檢測評估平行、紊亂的膠原支架、膠原-蠶絲支架的最大拉力,與正常家兔肩袖的力學(xué)性能進(jìn)行比較。取雌性3月齡新西蘭兔股骨髓腔內(nèi)紅骨髓原代提取RBMSCs,培養(yǎng)后傳代、凍存。利用流式細(xì)胞儀技術(shù)對提取的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。誘導(dǎo)RBMSCs進(jìn)行成骨、成軟骨、成脂肪分化,分別用茜素紅染色、阿利新藍(lán)染色和油紅染色觀察礦化鈣沉積、軟骨顆粒和脂肪微粒,評估RBMSCs的多向分化潛能。結(jié)果:平行的膠原支架呈現(xiàn)出光滑亮白的外觀,與肌腱相似,相比之下,紊亂的膠原支架如同海綿狀,表面相對粗糙,類似于松質(zhì)骨。平行的膠原支架其膠原纖維呈平行排列,而紊亂的膠原支架其膠原纖維為不規(guī)則排列。在相同膠原溶液濃度下,平行的膠原支架孔隙比紊亂的膠原支架孔隙略小。1Omg/ml的膠原支架空間拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)穩(wěn)定,相比6mg/ml和18mg/ml的膠原支架有更多的細(xì)胞長入。膠原纖維和網(wǎng)狀蠶絲能緊密結(jié)合在一起,平行、紊亂的膠原-蠶絲支架力學(xué)性能未見明顯差異,可勝任正常兔子肩袖的力學(xué)強(qiáng)度。對RBMSCs進(jìn)行成骨誘導(dǎo),茜素紅染色可見紅色礦化鈣沉積。對RBMSCs進(jìn)行成軟骨誘導(dǎo)后,阿利新藍(lán)染色可見藍(lán)綠色軟骨顆粒。對RBMSCs進(jìn)行成脂肪誘導(dǎo),油紅染色后可見紅色的脂肪微粒。結(jié)論:平行、紊亂的膠原支架及膠原-蠶絲支架可順利制作。10mg/ml的膠原濃度制作的支架細(xì)胞孔隙較大且空間拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)不易塌陷。平行、紊亂的膠原-蠶絲支架的力學(xué)性能主要取決于網(wǎng)狀蠶絲。原代提取、培養(yǎng)的RBMSCs具備成骨、成軟骨、成脂肪等多向分化潛能,其干細(xì)胞特性隨傳代次數(shù)逐漸降低。第二部分比較平行及紊亂的膠原支架對RBMSCs細(xì)胞形態(tài)、增殖、遷移的影響及成腱、成骨表達(dá)的作用目的:比較平行及紊亂膠原支架與RBMSCs的生物相容性,觀察其對RBMSCs細(xì)胞形態(tài)、遷移的影響,評估其能否促進(jìn)RBMSCs成腱、成骨。方法:將RBMSCs種植于平行、紊亂的膠原支架上,培養(yǎng)1天、3天、5天和7天。通過CCK-8試劑盒檢測RBMSCs在支架中的生長曲線,評估RBMSCs與不同空間拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)膠原支架的生物相容性。RBMSCs培養(yǎng)3天后,通過光鏡、掃描電鏡觀察平行、紊亂的膠原支架對RBMSCs形態(tài)學(xué)的影響。將平行、紊亂的膠原支架制成1cm×1cm大小,RBMSCs形成的pellet細(xì)胞球種植于支架中心,培養(yǎng)3天后掃描電鏡觀察膠原支架上RBMSCs的遷移情況。對RBMSCs進(jìn)行成腱、成骨誘導(dǎo)1周、2周后,利用RT-PCR檢測其成腱(ColⅠ、ColⅢ及TNC)、成骨(ColⅠ、RUNX-2及BMP-2)基因表達(dá)的差別,利用Western blotting檢測其成腱(ColⅢ及TNC)、成骨(RUNX-2及BMP-2)蛋白表達(dá)的差別。結(jié)果:通過CCK-8檢測發(fā)現(xiàn),RBMSCs在平行、紊亂的膠原支架上生長均良好,兩者比較未見顯著性差異。鏡下觀察,平行的膠原支架中RBMSCs形態(tài)多呈長梭狀,細(xì)胞長軸與膠原纖維的走形平行,紊亂的膠原支架中RBMSCs形態(tài)多為不規(guī)則,細(xì)胞分布無序。掃描電鏡觀察pellet細(xì)胞球中RBMSCs的遷移發(fā)現(xiàn),RBMSCs在平行的膠原支架上主要沿膠原纖維方向遷移,在紊亂的膠原支架上則呈放射狀遷移。RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn):對RBMSCs進(jìn)行成腱誘導(dǎo)后,平行的膠原支架組RBMSCs表達(dá)ColⅠ、COlⅢ及TNC基因高于紊亂的膠原支架組;進(jìn)行成骨誘導(dǎo)后,紊亂的膠原支架組RBMSCs表達(dá)Col Ⅰ、RUNX-2及BMP-2基因高于平行的膠原支架組。Western blotting檢測發(fā)現(xiàn):對RBMSCs進(jìn)行成腱誘導(dǎo)后,平行的膠原支架組RBMSCs表達(dá)ColⅢ及TNC蛋白高于紊亂的膠原支架組;進(jìn)行成骨誘導(dǎo)后,紊亂的膠原支架組RBMSCs表達(dá)RUNX-2及BMP-2蛋白高于平行的膠原支架組。結(jié)論:平行、紊亂的膠原支架與RBMSCs生物相容性均良好。膠原支架的空間拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)對細(xì)胞增殖影響不大,對RBMSCs的形態(tài)變化和遷移影響明顯。RBMSCs在平行的膠原支架中傾向于成腱表達(dá),在紊亂的膠原支架中傾向于成骨表達(dá)。第三部分比較平行及紊亂的膠原-蠶絲支架對家兔肩袖腱骨愈合的修復(fù)作用目的:評估平行及紊亂的膠原-蠶絲支架對家兔肩袖腱骨愈合的修復(fù)效果。方法:20只雌性4月齡新西蘭兔隨機(jī)分為平行的膠原-蠶絲支架組及紊亂的膠原-蠶絲支架組。每組設(shè)8周、12周兩個(gè)時(shí)間點(diǎn),每個(gè)時(shí)間點(diǎn)5只兔子。創(chuàng)建兔子肩袖損傷及修復(fù)模型,支架近端通過骨髓道與岡上肌斷端相連接,遠(yuǎn)端通過蠶絲纖維固定于骨隧道出口。在術(shù)后8周、12周收集肩袖樣本,通過組織學(xué)HE、Safirain-O染色、免疫組化、膠原含量測定、力學(xué)檢測等評估平行及紊亂的膠原-蠶絲支架對家兔肩袖腱骨愈合的修復(fù)效果。結(jié)果:組織學(xué)HE、Safrain-O染色及免疫組化證實(shí):紊亂的膠原-蠶絲支架組樣本的新生組織較平行膠原-蠶絲支架組的新生組織明顯致密,后期(術(shù)后12周)可見大片軟骨樣組織。力學(xué)檢測發(fā)現(xiàn):紊亂的膠原-蠶絲支架組樣本的最大拉力大于平行的膠原-蠶絲支架組。膠原含量測定發(fā)現(xiàn):紊亂的膠原-蠶絲支架組樣本的膠原含量多于平行的膠原-蠶絲支架組,且隨時(shí)間延長上述差距變得更加顯著。結(jié)論:與平行的膠原-蠶絲支架相比,紊亂的膠原-蠶絲支架更有助于腱骨愈合骨髓道壁細(xì)胞的粘附遷移,并誘導(dǎo)支架內(nèi)的細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞,從而在移植物與骨髓道交界面形成更多新生組織。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明,與平行的膠原-蠶絲支架相比,紊亂的膠原-蠶絲支架在腱骨愈合修復(fù)方面更有優(yōu)勢。
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R687.2
【部分圖文】：

膠原支架皮下異位種植??只雌性４月齡新西蘭兔，１０°／。水合氯醛按照０．３ｍｌ／１００ｇ體重比例醉；??備皮后，將兔子固定在無菌手術(shù)臺上，手術(shù)部位常規(guī)消毒，鋪巾；??取背部正中縱行切口長約１０ｃｍ，血管鉗將皮膚向兩側(cè)鈍性分離，期間將不同肢原濃度ｌｃｍｘｌｃｍ支架植入皮膚與皮下組織間隙，用縫線，從頭側(cè)至尾側(cè)排列依次為６ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１８ｍｇ／ｍｌ膠原濃度，膠原支架，右側(cè)為平行的膠原支架，做好標(biāo)記；??生理鹽水沖洗，消毒，縫皮；??兔子分籠飼養(yǎng)，自由活動，標(biāo)準(zhǔn)動物飼料喂養(yǎng)，潔凈飲水；??２周后，取出兔子體內(nèi)膠原支架，進(jìn)行組織學(xué)評估。??

圖１－４支架力學(xué)檢測??ＢＭＳＣｓ分離和培養(yǎng)??菌條件下，抽取雌性３月齡新西蘭兔股骨髓腔內(nèi)紅骨髓約５ｍｌ，中；??量ＰＢＳ浸泡后，將紅骨髓置入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速１２００轉(zhuǎn)／分鐘，清液，再次用ＰＢＳ浸泡洗滌后離心，共２次；??去上清液，加入ＢＭＳＣｓ培養(yǎng)基（１．２．３配置：低糖ＤＭＥＭ、１１００Ｕ／ｍｌ青霉素、１００Ｕ／ｍｌ鏈霉素），吹打，重懸，種植、５％Ｃ０２細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；??小時(shí)后予以換液，棄去懸浮細(xì)胞，每隔７２小時(shí)換液一次；??

圖１－５鏡下ＲＢＭＳＣｓ細(xì)胞形態(tài)??
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本文編號：2869640