成骨細(xì)胞是骨形成的主要功能細(xì)胞之一,成骨細(xì)胞的增殖和分化功能受到抑制時(shí),會(huì)使骨形成減慢,骨代謝失衡,并最終導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。成骨細(xì)胞的功能受到多種因素的影響,包括成骨細(xì)胞內(nèi)部的表觀和非表觀遺傳學(xué)因素,以及細(xì)胞外界的一些力學(xué)刺激等。但成骨細(xì)胞響應(yīng)力學(xué)刺激并啟動(dòng)內(nèi)部信號(hào)通路的機(jī)制至今仍不明確。微管微絲交聯(lián)分子(microtubule actin crosslinking factor 1,MACF1)是連接微絲和微管的細(xì)胞骨架蛋白,MACF1可以調(diào)控細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué),進(jìn)而參與力學(xué)刺激響應(yīng)、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞遷移、以及疾病發(fā)生等生物學(xué)過(guò)程。本團(tuán)隊(duì)前期研究表明,MACF1在成骨細(xì)胞增殖、分化過(guò)程中起重要作用。但MACF1對(duì)成骨細(xì)胞增殖和分化的調(diào)控機(jī)制目前尚未明確。因此,本研究目的旨在闡明MACF1對(duì)成骨細(xì)胞增殖調(diào)控作用及機(jī)制;并結(jié)合MACF1相關(guān)非編碼RNA,研究其對(duì)對(duì)成骨細(xì)胞分化的調(diào)控作用。為深入研究力學(xué)條件下MACF1的功能和成骨細(xì)胞增殖和分化的機(jī)制提供了理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),并且也對(duì)尋找骨質(zhì)疏松診斷和治療的新靶點(diǎn)具有非常重要的意義。研究方法:本研究首先采用三維隨機(jī)回轉(zhuǎn)儀和小鼠尾懸吊后肢去負(fù)荷模型,檢測(cè)在力學(xué)去負(fù)荷條件下MACF1在MC3T3-E1小鼠前成骨細(xì)胞以及C57BL/6小鼠股骨組織和股骨骨源間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)變化;采用MACF1高/低表達(dá)MC3T3-E1前成骨細(xì)胞模型,研究MACF1對(duì)成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性、細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)生成、成骨分化相關(guān)基因表達(dá)和細(xì)胞增殖速率的影響,并結(jié)合力學(xué)去負(fù)荷條件,檢測(cè)MACF1在力學(xué)去負(fù)荷條件下對(duì)β-catenin表達(dá)水平和活性的影響,以及β-catenin對(duì)成骨細(xì)胞增殖的調(diào)控作用。進(jìn)一步通過(guò)對(duì)MACF1低表達(dá)前成骨細(xì)胞進(jìn)行LncRNA、miRNA、mRNA表達(dá)譜基因芯片分析,結(jié)合生物信息學(xué)分析手段,篩選MACF1相關(guān)的成骨分化非編碼RNA,并通過(guò)CHIP-seq和JASPAR數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)MACF1對(duì)篩選獲得的非編碼RNA的調(diào)控作用。在老齡和尾懸吊骨質(zhì)疏松小鼠模型股骨組織中檢測(cè)篩選獲得的Lnc-DIF和miR-489-3p的表達(dá)變化。在前成骨細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Lnc-DIF-siRNA或miR-489-3p模擬物/抑制物,檢測(cè)細(xì)胞的成骨分化標(biāo)志基因表達(dá)水平、堿性磷酸酶活性和礦化結(jié)節(jié)生成速率、以及轉(zhuǎn)染Lnc-DIF-siRNA對(duì)前成骨細(xì)胞miR-489-3p水平的變化。通過(guò)熒光原位雜交技術(shù),檢測(cè)Lnc-DIF在MC3T3-E1前成骨細(xì)胞中的分布情況。通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)技術(shù),檢測(cè)了前成骨細(xì)胞中Lnc-DIF對(duì)miR-489-3p的結(jié)合作用。使用成骨細(xì)胞靶向遞送系統(tǒng)在去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠模型中轉(zhuǎn)染Lnc-DIF-siRNA,通過(guò)microCT技術(shù)檢測(cè)小鼠骨微結(jié)構(gòu)的變化。檢測(cè)轉(zhuǎn)染AK016739-siRNA后,前成骨細(xì)胞的堿性磷酸酶活性、礦化結(jié)節(jié)生成速率、以及成骨分化標(biāo)志基因和成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子水平的表達(dá)水平。并分別采用超景深顯微鏡、鈣黃綠素標(biāo)記、免疫組化和RT-PCR方法檢測(cè)去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠轉(zhuǎn)染AK016739-siRNA后的顱骨厚度、骨形成速率、成骨標(biāo)志因子蛋白水平和成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)變化。研究結(jié)果:(1)MACF1參與成骨細(xì)胞對(duì)力學(xué)條件的響應(yīng),調(diào)控成骨細(xì)胞功能在三維隨機(jī)回轉(zhuǎn)力學(xué)去負(fù)荷條件處理24和48 h后,小鼠前成骨細(xì)胞MC3T3-E1中MACF1的mRNA和蛋白表達(dá)水平均降低;在28天的尾懸吊力學(xué)去負(fù)荷處理后,小鼠股骨組織中MACF1的mRNA和蛋白水平,以及股骨骨源間充質(zhì)干細(xì)胞中MACF1的mRNA水平也明顯下調(diào)。在MACF1高/低表達(dá)前成骨細(xì)胞中,細(xì)胞的堿性磷酸酶活性、礦化結(jié)節(jié)生成和成骨分化相關(guān)基因表達(dá)均受到MACF1的正調(diào)控,同時(shí)細(xì)胞的增殖速率和增殖細(xì)胞比率也受到MACF1的正調(diào)控。力學(xué)去負(fù)荷條件對(duì)成骨細(xì)胞增殖的抑制作用受到了MACF1表達(dá)水平的影響:MACF1低表達(dá)時(shí)力學(xué)去負(fù)荷條件對(duì)成骨細(xì)胞的增殖抑制作用較弱。此外,結(jié)果顯示在MACF1高/低表達(dá)前成骨細(xì)胞中,β-catenin的mRNA與蛋白表達(dá)和β-catenin的活性也受到了MACF1的正調(diào)控;并且力學(xué)去負(fù)荷條件抑制β-catenin的mRNA表達(dá)的作用也在MACF1低表達(dá)時(shí)減弱。以siRNA干擾β-catenin表達(dá)可以抑制成骨細(xì)胞增殖,而氯化鋰處理則對(duì)上述過(guò)程有恢復(fù)效果。綜合分析以上結(jié)果,表明:力學(xué)去負(fù)荷條件抑制成骨細(xì)胞中的MACF1表達(dá);MACF1參與成骨細(xì)胞響應(yīng)力學(xué)去負(fù)荷條件,且正調(diào)控成骨細(xì)胞的增殖和分化;此外,MACF1對(duì)成骨細(xì)胞增殖的調(diào)控,通過(guò)β-catenin信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)。(2)MACF1相關(guān)非編碼RNA——Lnc-DIF及mir-489-3p的篩選及其對(duì)成骨細(xì)胞分化和骨形成的調(diào)控作用MACF1低表達(dá)前成骨細(xì)胞的lncRNA、miRNA、mRNA表達(dá)譜芯片的生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示:miR-489-3p在MACF1低表達(dá)成骨細(xì)胞中表達(dá)降低,且與成骨分化基因相關(guān)性最好,而Lnc-DIF在MACF1低表達(dá)成骨細(xì)胞中表達(dá)升高,且Lnc-DIF序列中存在多個(gè)miR-489-3p結(jié)合位點(diǎn)。CHIP-seq和JASPAR數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)了MACF1結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子在Lnc-DIF啟動(dòng)子區(qū)域存在結(jié)合位點(diǎn),說(shuō)明MACF1可能調(diào)控Lnc-DIF的轉(zhuǎn)錄。因此推測(cè),MACF1通過(guò)調(diào)控Lnc-DIF表達(dá),影響miR-489-3p對(duì)靶基因—成骨分化相關(guān)基因—的調(diào)控。在老齡和尾懸吊骨質(zhì)疏松小鼠模型的股骨組織中,Lnc-DIF表達(dá)升高。在前成骨細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Lnc-DIF的siRNA可以上調(diào)成骨分化標(biāo)志基因表達(dá),并且提高細(xì)胞堿性磷酸酶活性和礦化結(jié)節(jié)生成水平。熒光原位雜交結(jié)果表明Lnc-DIF在MC3T3-E1前成骨細(xì)胞中主要分布在細(xì)胞質(zhì)中;轉(zhuǎn)染Lnc-DIF-siRNA可升高前成骨細(xì)胞miR-489-3p水平,通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)證明了Lnc-DIF可以結(jié)合miR-489-3p。采用骨靶向遞送系統(tǒng)經(jīng)小鼠尾靜脈注射Lnc-DIF的siRNA可以恢復(fù)去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠的骨微結(jié)構(gòu)。miR-489-3p在老齡骨質(zhì)疏松患者骨組織、以及老齡和尾懸吊骨質(zhì)疏松小鼠模型股骨組織中低表達(dá)。在前成骨細(xì)胞中轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染miR-489-3p的模擬物或抑制物,分別促進(jìn)/抑制成骨細(xì)胞分化。綜合分析以上結(jié)果,表明:MACF1可能通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子負(fù)調(diào)控Lnc-DIF,而Lnc-DIF則通過(guò)結(jié)合miR-489-3p,抑制成骨細(xì)胞分化和骨形成。(3)MACF1相關(guān)長(zhǎng)鏈非編碼RNAAK016739的篩選及其對(duì)成骨細(xì)胞分化和骨形成的調(diào)控作用MACF1低表達(dá)前成骨細(xì)胞的基因芯片分析結(jié)果顯示,AK016739是與成骨分化基因相關(guān)性最好的長(zhǎng)鏈非編碼RNA。采用CHIP-seq和JASPAR數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄因子的手段驗(yàn)證了MACF1對(duì)其的調(diào)控作用。在MC3T3-E1前成骨細(xì)胞中轉(zhuǎn)染AK016739的siRNA可以提高成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性和礦化結(jié)節(jié)生成水平,并且促進(jìn)成骨細(xì)胞分化標(biāo)志基因和成骨分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。體內(nèi)轉(zhuǎn)染AK016739的siRNA可以恢復(fù)去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠的顱骨厚度、骨形成速率、成骨標(biāo)志因子蛋白水平和成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平。綜合分析以上結(jié)果,表明:MACF1可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子負(fù)調(diào)控AK016739,而AK016739則可以抑制成骨細(xì)胞分化和骨形成。結(jié)論:綜上所述,MACF1在成骨細(xì)胞響應(yīng)力學(xué)去負(fù)荷條件中扮演重要角色,并且對(duì)成骨細(xì)胞的增殖和分化功能起正調(diào)控作用。MACF1可以通過(guò)β-catenin來(lái)促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖。此外,還可以通過(guò)其下游的非編碼RNA:Lnc-DIF-miR-489-3p軸和AK016739正調(diào)控成骨細(xì)胞分化和骨形成。本研究闡明了力學(xué)響應(yīng)分子MACF1對(duì)成骨細(xì)胞增殖和分化的調(diào)控作用及調(diào)控機(jī)制,并且發(fā)現(xiàn)了新的調(diào)控成骨細(xì)胞分化的表觀遺傳學(xué)信號(hào)通路。本研究為闡明成骨細(xì)胞對(duì)力學(xué)去負(fù)荷條件的感知以及其對(duì)骨形成的影響提供了理論基礎(chǔ),同時(shí)也對(duì)骨代謝相關(guān)疾病的防治提供了新的潛在治療靶點(diǎn)。
【學(xué)位單位】：西北工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R68
【部分圖文】：

MACF1的結(jié)構(gòu)

促進(jìn)β-catenin 的入核以及下游轉(zhuǎn)錄因子 TCF7/LEF1 的活性（圖 1-2）。胡麗年的研究也證明了 MACF1 可以在成骨細(xì)胞中調(diào)控β-catenin 的入核和降解，MACF1 可以通過(guò)調(diào)控 Wnt/β-catenin 信號(hào)通路促進(jìn)成骨細(xì)胞分化[109]。此外，可以調(diào)控高爾基體相關(guān)的蛋白運(yùn)輸[110, 111]，高爾基體是負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)部合成蛋運(yùn)的細(xì)胞器，而研究表明，MACF1 可以調(diào)控高爾基體內(nèi)加工后的蛋白囊泡的反式面轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)的微管上的驅(qū)動(dòng)蛋白，從而調(diào)控細(xì)胞內(nèi)蛋白的分配[1MACF1分子上還存在一個(gè)GSK-3β的磷酸化位點(diǎn)，這暗示了MACF1可能會(huì)調(diào)的功能[101, 112]。

圖 1-3 lncRNA 的功能[152]Fig.1-3 Functions of lncRNAslncRNA 對(duì)轉(zhuǎn)錄的調(diào)控可以通過(guò)直接與染色體結(jié)合，并調(diào)控基因的組蛋白修飾水平，影響基因的轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn)，包括 Xist、Tsix 和 Xite 在內(nèi)的多種 lncRNA 都可以通過(guò)召集組蛋白 H3K27 甲基化酶復(fù)合體或組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶的方式使基因失活。研究發(fā)現(xiàn)，Xist（X 染色體失活特異轉(zhuǎn)錄因子，X-inactive specific transcript）可以在染色體失活中心與 RepA 和 PRC2 形成復(fù)合物，并結(jié)合到 lncRNAXist 的啟動(dòng)子區(qū)，反式激活 Xist 的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，隨后 Xist 與 PRC2 結(jié)合，并沿 X 染色體移動(dòng)使 X 染色體失活[153]。此外，lncRNAKcnqlot1 可以通過(guò)召集 PRC2 的方式，通過(guò)甲基化修飾等方法使目標(biāo)基因失活[154]。而lncRNA HOTTIP 則可以召集 WDR5/MLL 復(fù)合物使 HOXA 位點(diǎn)甲基化，從而激活位點(diǎn)附近基因的表達(dá)[155]。此外，lncRNA 對(duì)轉(zhuǎn)錄的調(diào)控除了可以召集并形成轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合物的方式以外，還可以通過(guò)與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的方式調(diào)控基因表達(dá)。例如，lncRNAPANDA可以結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子 NF-YA，對(duì)促凋亡基因的表達(dá)起抑制作用[156]。lncRNA 可以通過(guò)調(diào)控 mRNA 的可變剪接來(lái)對(duì)轉(zhuǎn)錄后的 mRNA 進(jìn)行調(diào)控。mRNA在轉(zhuǎn)錄后，其前體（pre-mRNA）必須通過(guò)可變剪接產(chǎn)生不同的轉(zhuǎn)錄本，繼而翻譯成不
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