目的:探討膜聯(lián)蛋白A3(Annexin A3、ANXA3)在骨肉瘤細胞系HOS與成骨細胞系中的表達差異及意義,尋求針對骨肉瘤靶向治療的新方法。方法:首先應(yīng)用細胞免疫熒光證實ANXA3是否在骨肉瘤細胞中表達,再采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、Western blot法分別檢測ANXA3在成骨細胞系及骨肉瘤細胞系HOS和U2OS細胞中的表達水平,再通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將小干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染到HOS細胞系中,下調(diào)HOS細胞系中ANXA3的表達。將siRNA轉(zhuǎn)染進HOS細胞6小時后通過熒光顯微鏡觀察siRNA轉(zhuǎn)染進入HOS細胞情況,轉(zhuǎn)染48小時后收集細胞,提取細胞中總蛋白后通過Western blot法檢測轉(zhuǎn)染48小時后HOS細胞中ANXA 3的蛋白表達情況,確定ANXA3在骨肉瘤細胞系HOS中表達下調(diào),再通過流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染前后HOS細胞的凋亡率。結(jié)果:1.通過激光共聚焦顯微鏡觀察到ANXA3在骨肉瘤細胞中表達;2.通過RT-PCR、Western blot檢測成骨細胞與骨肉瘤細胞中ANXA3表達量,發(fā)現(xiàn)ANXA3在骨肉瘤細胞系HOS及U2OS中RNA水平和蛋白表達水平均較成骨細胞系顯著升高、而HOS中ANXA3的水平升高更明顯;3.將3種si RNA轉(zhuǎn)染至HOS細胞系后,通過Western blot檢測HOS細胞的轉(zhuǎn)染效率,結(jié)果顯示各實驗組ANXA3表達均明顯下調(diào);4.通過流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染前后HOS細胞的凋亡情況,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后各組凋亡率較轉(zhuǎn)染前均明顯增加。結(jié)論:ANXA3在骨肉瘤細胞系中高表達,下調(diào)HOS細胞中ANXA3的表達可使其凋亡增加。
【學(xué)位單位】：桂林醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R738.1
【部分圖文】：

（90%培養(yǎng)基+10%DMSO 或 90%血清+10%DMSO）均勻吹散細胞，用移液器輕輕移入準備好的凍存管中。用封口膜封裹瓶口并標記好，依次放入4 ℃ 30min、-20 ℃ 30min、-80℃過夜（也可直接裝入程序降溫盒后直接放入-80℃冰箱），之后存放于液氮中長久保存。細胞復(fù)蘇時應(yīng)遵循快速復(fù)蘇原則，復(fù)蘇時應(yīng)盡快在水浴鍋中將細胞解凍。首先將完全培養(yǎng)基置于恒溫水浴箱（37℃）預(yù)熱 30min 備用。之后取7ml 培養(yǎng)基置于 25cm2細胞培養(yǎng)瓶中。隨后帶保暖手套小心從液氮罐中取出凍存的細胞，立即放入 37℃水浴鍋中，并不斷輕輕搖晃，使凍存管中細胞懸液盡快融化。然后迅速將細胞懸浮液移入至高壓滅菌過的細胞培養(yǎng)瓶中，輕輕晃動培養(yǎng)瓶，使細胞均勻散開，在顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)，隨后將培養(yǎng)瓶放入孵育箱中。

2 結(jié)果2.1 激光共聚焦顯微鏡觀察膜聯(lián)蛋白 A3 在骨肉瘤細胞中表達本實驗通過細胞免疫熒光初步檢測細胞系 HOS、U2OS 中 ANXA3 的達情況，證實細胞中 ANXA3 在骨肉瘤細胞系中表達。圖 a 顯示紅色為蛋ANXA3 的表達情況，圖 b 為細胞核染，圖 c 為細胞融合圖，從圖 1、圖中我們可以明顯看出 ANXA3 在細胞系 HOS、U2OS 中表達。（圖 2、圖

圖 3. 激光共聚焦顯微鏡檢測骨肉瘤 U2OS 細胞中 ANXA3 的表達a. ANXA3 表達情況;b.細胞核染色;c.細胞融合Figure 3. Laser confocal microscopy to detect ANXA3 expression in osteosarcoma U2OS cellsa.ANXA3 expression; b.Nuclear staining; c.Cell fusion2.2 RT-PCR 檢測膜聯(lián)蛋白 A3 在成骨細胞及骨肉瘤細胞中的表達通過細胞系 HOS、U2OS 的細胞免疫熒光實驗，我們得知骨肉瘤細系中 ANXA3 是表達的，為了驗證成骨細胞與骨肉瘤細胞系中 ANXA3 的體表達情況與是否存在差異，本實驗通過 RT-PCR 從基因水平檢測表達情及是否存在差異，實驗結(jié)果顯示與成骨細胞對照組相比，HOS 細胞系U2OS 細胞系較成骨細胞組明顯升高，其中在 HOS 細胞系中升高更明顯

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前5條

1 李朝旭;王銳英;唐際存;;丙戊酸鈉增強γδT細胞對骨肉瘤的殺傷[J];中華實驗外科雜志;2016年01期

2 李朝旭;王銳英;唐際存;;γδT細胞對耐甲氨蝶呤骨肉瘤細胞株U2OS的殺傷作用[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;2015年07期

3 李朝旭;王銳英;唐際存;;Ⅰ型IFN體外增強人γδT細胞對骨肉瘤的殺傷作用[J];中國免疫學(xué)雜志;2014年11期

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本文編號：2828184