發(fā)布時間：2017-03-31 13:06

  本文關鍵詞：極低頻電磁場對骨肉瘤HOS細胞的體外生物效應及作用機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景:骨肉瘤(Osteosarcoma,OS)是一種常見的惡性程度高,早期即可發(fā)生肺部轉移并且死亡率較高的骨科惡性腫瘤,好發(fā)于兒童和青少年年齡段[1-2]。目前國內外主流的治療方案仍然以早期外科手術擴大范圍清除原發(fā)病灶,以及術后積極采用聯(lián)合多種化療藥物等為主,但始終無法徹底根除骨肉瘤細胞,術后復發(fā)或發(fā)生轉移的患者仍屢見不鮮,導致當前骨肉瘤治療的研究也陷入艱難困境。隨著當今科學技術的突飛猛進,使得跨學科交叉合作式研究逐漸成為一種全新的模式,而且國內外研究人員也已經(jīng)嘗試了物理學手段結合生物學效應的新模式來研究對惡性腫瘤的作用。極低頻電磁場(Extremely low frequency electromagnetic field,ELF-EMF)對惡性腫瘤的作用研究就是近年來這其中涌現(xiàn)出的一個跨學科研究的新模式,并且已經(jīng)取得了一些研究成果。目前研究證實了,特定參數(shù)的極低頻電磁場對惡性腫瘤細胞的增殖有抑制作用或者可以誘導其細胞凋亡[3-8]。此外,美國食品和藥品管理局(FDA)早在1979年就正式核準了極低頻電磁場可以應用于臨床疾病的治療和康復,這也充分肯定了適當?shù)腅LF-EMF對人體是安全可靠的。近年來,腫瘤干細胞理論研究的熱潮也為破解惡性骨腫瘤治療的困局帶來了新的思路和努力方向。該理論認為腫瘤組織的生長和增殖主要依賴于數(shù)量很少的腫瘤干細胞,而其他大部分細胞沒有或者只有有限的增殖能力,只有這部分腫瘤干細胞可以無限增殖。只要能夠有效地抑制或者殺死這部分腫瘤干細胞就可以給腫瘤的治療和研究帶來重大突破。經(jīng)研究表明,多種類型的腫瘤側群細胞(sp細胞)均具有干細胞的特性[9-10]。所以,本研究選用骨肉瘤細胞系hos細胞為體外實驗細胞,首先將通過檢測對照組及經(jīng)elf-emf輻照組細胞的增殖、凋亡、克隆形成能力、侵襲能力等,來篩選不同電磁場強度及電磁場頻率的elf-emf對體外骨肉瘤hos細胞的生物學效應強弱,經(jīng)過綜合評估后優(yōu)化出對hos細胞生物效應最強的一組elf-emf參數(shù)。然后,采用優(yōu)化參數(shù)的elf-emf對hos細胞進行輻照,觀察與對照組的sp細胞比率變化,再利用流式細胞儀無菌分選出骨肉瘤hos細胞的sp細胞繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng),用優(yōu)化參數(shù)的elf-emf輻照sp細胞及改變干預條件,通過蛋白免疫印跡實驗(westernblot,wb)檢測目標蛋白的表達情況,進而研究可能的信號通路作用機制。我們希望通過這一系列的實驗研究,為最終能夠將elf-emf應用到臨床治療骨肉瘤提供實驗依據(jù)和可能的作用機制參考。實驗一極低頻電磁場對骨肉瘤hos細胞的體外生物效應及電磁場參數(shù)的優(yōu)化篩選目的:通過檢測elf-emf輻照組及對照組骨肉瘤hos細胞的細胞增殖、細胞凋亡、細胞克隆形成能力、細胞侵襲能力等,來篩選不同強度及頻率的elf-emf對骨肉瘤hos細胞的體外生物效應強弱,經(jīng)過統(tǒng)計學分析后優(yōu)化出對骨肉瘤hos細胞有較強生物效應的elf-emf參數(shù)。方法:常規(guī)培養(yǎng)骨肉瘤hos細胞,按照固定電磁場強度為0.1mt、1mt、5mt、10mt、15mt,再分別選擇不同電磁場頻率為1hz、5hz、10hz、15hz、20hz、30hz、40hz、50hz進行分組輻照,一天2小時,連續(xù)輻照5天,并設立對照組。然后利用cck-8法檢測骨肉瘤hos細胞的增殖變化情況,并根據(jù)od值計算各組的抑制率。經(jīng)統(tǒng)計學分析后,篩選出對hos細胞抑制作用較強的2組elf-emf參數(shù),再采用細胞凋亡、克隆形成能力及侵襲能力等實驗檢測進行驗證。結果:經(jīng)統(tǒng)計學分析各組OD值,我們得出(1 Hz,0.1 m T)組細胞增殖抑制率最強,(40 Hz,10 m T)組次之(P0.05)。流式細胞儀檢測結果表明,(40 Hz,10 m T)組骨肉瘤HOS細胞凋亡比率高于其他兩組(P0.05)。克隆形成能力實驗顯示,對照組細胞克隆率最大,(1 Hz,0.1 m T)實驗組細胞克隆率次之,而(40 Hz,10 m T)實驗組最小(P0.05)。侵襲能力實驗結果提示,(40 Hz,10 m T)組穿過Transwell小室的HOS細胞數(shù)量顯著低于其他兩組(P0.05)。結論:(40Hz,10 m T)實驗組ELF-EMF參數(shù)對HOS細胞有更顯著的抑制增殖作用,促進其細胞凋亡,也可減弱其細胞的克隆能力,并降低其侵襲能力。實驗二極低頻電磁場對骨肉瘤HOS細胞作用機制研究目的:通過利用優(yōu)化參數(shù)的ELF-EMF對骨肉瘤HOS細胞進行輻照,觀察實驗組與對照組的SP細胞比率改變情況,并利用向培養(yǎng)基中加入順鉑(CDDP)上調VEGF/Flt1自分泌信號,利用蛋白免疫印跡實驗檢測目標蛋白的表達情況,開展可能的信號通路作用機制的研究。方法:常規(guī)培養(yǎng)HOS細胞,利用流式細胞儀分別鑒定經(jīng)優(yōu)化參數(shù)的ELF-EMF輻照組和對照組SP細胞比率。應用流式細胞儀篩選出骨肉瘤HOS細胞的SP細胞常規(guī)培養(yǎng),分成經(jīng)優(yōu)化參數(shù)的ELF-EMF輻照實驗組,CDDP共培養(yǎng)實驗組,CDDP共培養(yǎng)加ELF-EMF輻照實驗組,并設立對照組,采用蛋白印跡實驗檢測目標蛋白表達的差異情況。結果:通過流式細胞儀雙染分析,經(jīng)優(yōu)化參數(shù)的ELF-EMF輻照組SP細胞比率較對照組低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。蛋白印跡實驗結果顯示,經(jīng)ELF-EMF輻照實驗組VEGF/Flt1蛋白表達水平相較于對照組明顯下降,并且明顯抑制了SP細胞的phospho-ERK1,2的磷酸化過程,但對ERK1,2的表達無明顯影響。結論:優(yōu)化參數(shù)的ELF-EMF可能是通過下調骨肉瘤HOS細胞的側群細胞VEGF/Flt1蛋白表達以及抑制側群細胞的phospho-ERK1,2磷酸化過程,從而最終抑制了骨肉瘤HOS細胞的增殖。
【關鍵詞】：極低頻電磁場 骨肉瘤HOS細胞 凋亡 克隆形成 侵襲 流式細胞儀 順鉑 VEGF/Flt1 phospho-ERK1 2 蛋白印跡實驗
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R738.1
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 前言13-15
• 文獻回顧15-23
• 1 骨肉瘤（OS）的研究現(xiàn)狀16-19
• 2 極低頻電磁場（ ELF-EMF ）的研究現(xiàn)狀19-21
• 3 腫瘤干細胞理論( TSC )的研究現(xiàn)狀21-23
• 實驗一 極低頻電磁場對骨肉瘤HOS細胞的體外生物效應及電磁場參數(shù)的優(yōu)化篩選23-38
• 1 材料23-24
• 2 方法24-31
• 3 結果31-35
• 4 討論35-38
• 實驗二 極低頻電磁場對骨肉瘤HOS細胞作用機制研究38-52
• 1 材料38-39
• 2 方法39-47
• 3 結果47-50
• 4 討論50-52
• 小結52-53
• 參考文獻53-63
• 個人簡歷和研究成果63-64
• 致謝64-66

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9 朱U，

本文編號：279630