【摘要】：背景及目的:骨肉瘤(Osteosarcoma,OS)是一種高度惡性腫瘤,10%-20%患者確診時(shí)病灶已發(fā)生轉(zhuǎn)移。由于骨肉瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的病理過程,涉及到多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,因此,骨肉瘤高轉(zhuǎn)移、高侵襲特性相關(guān)機(jī)制是人們長(zhǎng)期關(guān)注的課題。近年來,人們?cè)噲D通過探討上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial mesenchymal transition,EMT)及其相關(guān)蛋白的作用,闡明惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制。EMT是指上皮細(xì)胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過程,可導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)細(xì)胞的連接的喪失,以及對(duì)一個(gè)移動(dòng)和遷移表型的獲取,從而引起基底膜的侵入,最終可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)移。骨肉瘤是間葉組織源性的最常見的骨惡性腫瘤。雖然,以往的研究認(rèn)為,EMT僅發(fā)生在上皮細(xì)胞來源的惡性腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中,但隨著研究的深入,有實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)間質(zhì)來源的肉瘤細(xì)胞或干細(xì)胞同樣可通過改變EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)增強(qiáng)轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn),骨肉瘤轉(zhuǎn)移患者瘤體組織中相對(duì)高表達(dá)N-cadherin和Snail蛋白,相對(duì)低表達(dá)E-cadherin蛋白[150];同時(shí),在多種骨肉瘤細(xì)胞系中,細(xì)胞可通過調(diào)節(jié)EMT相關(guān)蛋白的表達(dá),增強(qiáng)細(xì)胞侵襲能力[140],[145],這些結(jié)果提示EMT不僅是上皮細(xì)胞來源腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟,人們認(rèn)為在間質(zhì)細(xì)胞來源的骨肉瘤中可能也同樣存在EMT或EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的改變,從而參與了骨肉瘤轉(zhuǎn)移的形成機(jī)制。目前認(rèn)為EMT的實(shí)質(zhì)極有可能是腫瘤細(xì)胞通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)現(xiàn)獲得轉(zhuǎn)移能力的一種生命現(xiàn)象[157]。預(yù)示著EMT相關(guān)蛋白表達(dá)變化過程中存在更深層次的轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳變異,因此,需要進(jìn)一步探討EMT相關(guān)蛋白在骨肉瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的作用。迄今研究認(rèn)為,作為吸引白細(xì)胞移行到感染部位的一些低分子量的多種趨化因子及相關(guān)受體參與了乳腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、胰腺導(dǎo)管細(xì)胞癌和肝癌等腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移[158-159]。骨肉瘤的腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment,TME)中存在大量巨噬細(xì)胞[152-153],巨噬細(xì)胞可通過分泌TNF-α、TNF-β、IL-lα、IL-1β誘導(dǎo)CXCL6表達(dá)[154]。同時(shí),Li[120]等研究發(fā)現(xiàn),CXCL6在骨肉瘤患者的血清中呈現(xiàn)高表達(dá),且體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)添加重組人CXCL6可顯著促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖。CXCL6的受體為CXCR1和CXCR2,其與CXCR2的結(jié)合力強(qiáng)于CXCR1,并且僅是CXCR2內(nèi)化的強(qiáng)效誘導(dǎo)劑[155]。CXCR2除了參與腫瘤血管生成外,還與多種腫瘤細(xì)胞的EMT過程密切相關(guān)[121-123]。在CXCR2發(fā)揮促進(jìn)EMT作用的多條信號(hào)通路中,PI3K/Akt相關(guān)報(bào)道最多。另一方面,β-catenin是經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路的核心,研究發(fā)現(xiàn),β-catenin可與E-cadherin形成復(fù)合物,該復(fù)合物可調(diào)控EMT,從而在腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮重要的作用。目前認(rèn)為PI3K/Akt信號(hào)通路可通過抑制GSK-3β的活性,從而促進(jìn)β-catenin的核轉(zhuǎn)移,即PI3K/Akt信號(hào)通路可促進(jìn)Wnt/β-catenin信號(hào)通路活化[147,148]。提示通過研究腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中PI3K/Akt信號(hào)與其他信號(hào)途徑的交互調(diào)控機(jī)制,可能為闡明趨化因子調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移機(jī)制提供了新的線索。綜上所述,骨肉瘤的微環(huán)境中存在大量的巨噬細(xì)胞,它們可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分泌CXCL6,且骨肉瘤患者血清中CXCL6呈高表達(dá),此外,CXCL6可與具有EMT誘導(dǎo)作用的CXCR2特異性高效結(jié)合,由此可推測(cè),趨化因子CXCL6與其受體CXCR2在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展過程中,能夠通過調(diào)節(jié)EMT相關(guān)蛋白的表達(dá),提高骨肉瘤細(xì)胞的遷移、侵襲能力,從而促進(jìn)骨肉瘤的轉(zhuǎn)移�；谏鲜龇治�,本課題選擇趨化因子CXCL6與其受體CXCR2為研究對(duì)象,探討其對(duì)骨肉瘤細(xì)胞遷移、侵襲以及EMT相關(guān)蛋白的作用,并探究PI3K/Akt、β-catenin信號(hào)通路在趨化因子CXCL6介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移中的作用,以期能為骨肉瘤的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的早期診斷和治療提供相關(guān)的理論和實(shí)踐依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)利用轉(zhuǎn)移能力不同的四種骨肉瘤細(xì)胞系,確定趨化因子CXCL6及其受體CXCR2表達(dá)與骨肉瘤轉(zhuǎn)移能力的相關(guān)性;利用CXCL6中和抗體,觀察其對(duì)轉(zhuǎn)移能力相對(duì)較強(qiáng)的MG63、143B細(xì)胞系轉(zhuǎn)移能力及EMT相關(guān)蛋白的影響,確認(rèn)趨化因子CXCL6及其受體CXCR2與骨肉瘤EMT相關(guān)蛋白之間的可能關(guān)系;同時(shí),我們利用重組人CXCL6驗(yàn)證其能否影響轉(zhuǎn)移能力相對(duì)較弱的Sa OS-2、U2OS細(xì)胞系的遷移、侵襲及EMT相關(guān)蛋白的表達(dá),并在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證趨化因子CXCL6與其受體CXCR2對(duì)裸鼠骨肉瘤生長(zhǎng)和肺轉(zhuǎn)移的影響;最后利用PI3K/Akt和β-catenin信號(hào)通路阻滯劑、沉默CXCR2探討趨化因子CXCL6與其受體CXCR2引起骨肉瘤患者發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制。方法:1.利用TCGA(The Cancer Genome Atlas,癌癥基因組圖譜)中骨肉瘤(Osteosarcoma)的數(shù)據(jù),采用R語言軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,利用Fisher.test函數(shù)進(jìn)行Fisher精確檢驗(yàn),分析CXCL6、CXCR2m RNA的表達(dá)與骨肉瘤患者發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)性;2.采用RT-PCR、Western blot法檢測(cè)四種骨肉瘤細(xì)胞系MG63、143B、Sa OS-2及U2OS細(xì)胞中CXCL6、CXCR2的表達(dá)情況,并采用Transwell法檢測(cè)上述骨肉瘤細(xì)胞系的遷移和侵襲能力的強(qiáng)弱與CXCL6表達(dá)高低的關(guān)系;3.以重組人CXCL6處理骨肉瘤細(xì)胞MG63、143B、Sa OS-2及U2OS,利用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的存活情況;4.以CXCL6中和抗體處理MG63、143B細(xì)胞,利用Transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲情況,應(yīng)用Western blot法檢測(cè)E-cadherin、N-cadherin及Snail蛋白的表達(dá)情況,應(yīng)用免疫熒光檢測(cè)E-cadherin和N-cadherin蛋白的表達(dá)和分布情況。5.采用si RNA技術(shù)沉默Sa OS-2、U2OS細(xì)胞中CXCR2,并以重組人CXCL6處理細(xì)胞,利用Transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲情況,免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin蛋白的表達(dá);Western blot檢測(cè)細(xì)胞中MMP-9、Snail、phospho-Akt Ser473、Akt、核β-catenin蛋白的表達(dá)。應(yīng)用LY294002和XAV939阻滯PI3K/Akt和β-catenin信號(hào)通路,并以重組人CXCL6處理細(xì)胞,通過采用Transwell法和Western blot法,考察細(xì)胞遷移、侵襲和EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的情況。6.為了驗(yàn)證CXCL6促進(jìn)骨肉瘤轉(zhuǎn)移的作用,我們選取了CXCL6表達(dá)與轉(zhuǎn)移性較低的U2OS細(xì)胞,通過慢病毒感染U2OS細(xì)胞,構(gòu)建并篩選高表達(dá)CXCL6的U2OS細(xì)胞,利用高表達(dá)CXCL6的U2OS細(xì)胞建立裸鼠皮下荷瘤模型和尾靜脈肺轉(zhuǎn)移模型。給予裸鼠腹腔注射CXCR2拮抗劑SB225002,利用腫瘤生長(zhǎng)曲線、瘤體質(zhì)量、免疫組化法及Western blot法,考察趨化因子CXCL6與其受體CXCR2對(duì)腫瘤生長(zhǎng)和增殖的調(diào)控作用;利用肺組織HE染色觀察肺轉(zhuǎn)移情況,考察趨化因子CXCL6與其受體CXCR2對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的調(diào)控作用。結(jié)果:1.提取TCGA(TCGA data version 2016_01_28 for SARC)中同時(shí)具有臨床信息與CXCL6和CXCR2m RNA的表達(dá)信息的骨肉瘤病例266例,其中175例患者具有轉(zhuǎn)移的信息,利用Fisher精確檢驗(yàn),結(jié)果顯示,CXCL6與其受體CXCR2在m RNA表達(dá)水平上呈正相關(guān)(P=0.0006)。同時(shí),CXCL6m RNA表達(dá)與患者發(fā)生轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P=0.009645)。2.四種骨肉瘤細(xì)胞株中CXCL6、CXCR2在基因水平和蛋白水平均呈高表達(dá),同時(shí),CXCL6表達(dá)越高,細(xì)胞的遷移和侵襲能力越強(qiáng)。3.CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示,重組人CXCL6(100ng/ml)處理MG63、143B、Sa OS-2及U2OS細(xì)胞48h后,與空白對(duì)照組相比較,細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)(P㩳0.05)。4.CXCL6中和抗體能夠降低骨肉瘤細(xì)胞MG63、143B遷移和侵襲能力,同時(shí)使細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白Snail、N-cadherin的表達(dá)明顯降低,E-cadherin蛋白的表達(dá)明顯的升高。5.在CXCR2基因沉默后,重組人CXCL6促進(jìn)Sa OS-2、U2OS細(xì)胞的遷移和侵襲的效果明顯降低,同時(shí)EMT相關(guān)蛋白E-cadherin、N-cadherin以及信號(hào)通路相關(guān)蛋白p-Akt/Akt和核β-catenin的相對(duì)表達(dá)量受重組人CXCL6的影響也顯著減小;加入LY294002和XAV939信號(hào)通路阻滯劑后,Sa OS-2、U2OS細(xì)胞中MMP-9、Snail和N-cadherin的表達(dá)明顯減少,E-cadherin的表達(dá)顯著增加。6.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,皮下注射CXCL6高表達(dá)的U2OS細(xì)胞可促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)及瘤體中的增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA)、p-Akt/Akt及胞核β-catenin蛋白等的表達(dá),而注射CXCR2拮抗劑后,細(xì)胞增殖蛋白PCNA、p-Akt/Akt和胞核β-catenin蛋白的相對(duì)表達(dá)量均降低。在肺轉(zhuǎn)移模型中,CXCL6可顯著促進(jìn)腫瘤細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移,注射CXCR2拮抗劑后,肺部轉(zhuǎn)移灶明顯減少。高表達(dá)CXCL6能夠增加成瘤率與肺部轉(zhuǎn)移率,同時(shí),增加肺部組織轉(zhuǎn)移灶的形成;給予CXCR2拮抗劑后,雖然肺部轉(zhuǎn)移率并未見明顯變化,但是,其病理學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示肺部組織轉(zhuǎn)移灶的形成明顯減少。結(jié)論:1通過TCGA數(shù)據(jù)分析以及趨化因子CXCL6差異表達(dá)的四種骨肉瘤細(xì)胞遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè),我們推測(cè)骨肉瘤趨化因子CXCL6的表達(dá)可能與轉(zhuǎn)移能力有關(guān);2利用CXCL6中和抗體或沉默趨化因子受體CXCR2能夠抑制骨肉瘤細(xì)胞趨化因子CXCL6介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移能力,并改變EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)。表明趨化因子CXCL6與其受體CXCR2結(jié)合,可以調(diào)控EMT相關(guān)蛋白的表達(dá),從而引起骨肉瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移。3用PI3K/Akt和β-catenin信號(hào)通路阻滯劑能夠阻斷趨化因子CXCL6引起的EMT相關(guān)蛋白表達(dá)。提示趨化因子CXCL6與其受體CXCR2可能通過調(diào)控PI3K/Akt和β-catenin信號(hào)通路,引起EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的變化,參與了骨肉瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制。4體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了趨化因子CXCL6與其受體CXCR2能夠影響骨肉瘤在裸鼠皮下生長(zhǎng)與肺轉(zhuǎn)移,進(jìn)一步支持趨化因子CXCL6與其受體CXCR2通過調(diào)控PI3K/Akt與β-catenin信號(hào)通路參與了骨肉瘤的轉(zhuǎn)移。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R738.1
【圖文】：

吉林大學(xué)博士學(xué)位論文接毗鄰的區(qū)域,從而形成繼發(fā)腫瘤的過程 在原發(fā)部 Tumor），相對(duì)于原發(fā)瘤而言，在遠(yuǎn)隔部位生長(zhǎng)r） 最新研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞可以依靠血管趨向性機(jī)剖結(jié)構(gòu)的外表面持續(xù)遷移進(jìn)行擴(kuò)散，逃避化療藥腫瘤轉(zhuǎn)移不但是惡性腫瘤的重要生物學(xué)特征，也是更是近年來癌癥臨床治療的主要瓶頸[21] 目前，探方法已成為治療癌癥的研究熱點(diǎn)

igure 1.2 Steps in the development of tumor metastas（引自文獻(xiàn)[22]）圖 1.2 腫瘤轉(zhuǎn)移的步驟腫瘤轉(zhuǎn)移影響因素移與腫瘤的發(fā)生一樣，是一個(gè)多因素相互作用ǐ各步驟相互細(xì)胞轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制非常復(fù)雜，至今仍對(duì)其了解甚少，下面綜述 力作用惡性腫瘤細(xì)胞的快速生長(zhǎng)和不斷增殖，導(dǎo)致腫瘤體積逐漸增壓力的增加有利于瘤體表面的細(xì)胞向壓力低的方向侵襲，并隙做平面上的和空間內(nèi)的浸潤(rùn) 由此可見，原發(fā)瘤的壓力作離出來提供了有利條件[23] 附作用分子（Cell adhesion molecules，CAMs）是一類由細(xì)胞產(chǎn)生，

吉林大學(xué)博士學(xué)位論文L6 中和抗體對(duì)骨肉瘤細(xì)胞遷移ǐ侵襲的影響ELISA 檢測(cè) 143B 和 MG63 細(xì)胞上清中 CXCL6 的基礎(chǔ)含量 143B 細(xì)胞上清中 CXCL6 的基礎(chǔ)含量隨著細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)量從 409.855±40.859pg/ml 上升到 8996.661±946.288pg/ml，MG6 基 礎(chǔ) 含 量 在 0h-96h 內(nèi) 含 量 從 217.602±22.271pg/m65.320pg/ml，如 Figure 2.5 結(jié)合參考文獻(xiàn)和抗體說明書，根據(jù)加入 CXCL6 中和抗體 10μg/ml，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 鄧長(zhǎng)華;王怡;;老年手部骨肉瘤患者血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及血管生成素-2表達(dá)的價(jià)值研究[J];河北醫(yī)藥;2019年03期

2 張浩強(qiáng);魯亞杰;李明輝;李旭升;甄平;王臻;;多發(fā)骨肉瘤的診療現(xiàn)狀及起源問題初步探討[J];中國(guó)骨與關(guān)節(jié)雜志;2019年01期

3 韋秋業(yè);鄒崇祺;賴昌生;;趨化因子受體4在骨肉瘤中的作用及機(jī)制的研究進(jìn)展[J];右江醫(yī)學(xué);2017年05期

4 王玲;王燕;馮琛;潘禹錚;張英澤;;骨肉瘤免疫治療的研究進(jìn)展[J];中華老年骨科與康復(fù)電子雜志;2017年06期

5 劉媛;胡愛玲;張美芬;;骨肉瘤病人父母照護(hù)體驗(yàn)的質(zhì)性研究[J];護(hù)理研究;2013年29期

6 張雪蓮;山慈明;張俊娟;;骨肉瘤病人家屬照顧負(fù)荷的質(zhì)性研究[J];護(hù)理研究;2013年23期

7 劉金釗,張佐倫;骨肉瘤病人雌孕激素受體表達(dá)與臨床及預(yù)后的關(guān)系[J];青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2002年01期

8 管忠震;喻V腔

本文編號(hào)：2790816