【摘要】：背景和目的由于先天性畸形導致外觀上的不對稱,外傷或是手術(shù)后的軟組織缺損或容量減少的現(xiàn)象一直是修復(fù)重建外科學中所面臨的重大挑戰(zhàn)。脂肪移植作為自體來源的移植物,其獲取較容易、操作簡單,因富含成人干細胞,脂肪不僅有填充作用,還可以改善缺血組織的存活與再生,近年來逐漸成為一種重要的軟組織修復(fù)工具。盡管脂肪移植后效果顯著長期觀察移植后的脂肪移植物可能出現(xiàn)高吸收率,甚至是油囊、纖維化等并發(fā)癥。近年有學者在臨床研究中提出婦女的年齡(大于或小于45歲)是脂肪抽吸物中脂肪細胞存活的差異點;在動物模型中,降低雌激素可干擾脂肪移植物保留。目前,雌激素水平對于脂肪移植的保留率影響仍不明確。因此,我們分別模擬絕經(jīng)前期(CON組,正常雌激素)、絕經(jīng)期(OVX組,低雌激素)及孕期(HE組,高雌激素)來探討雌激素對脂肪移植物的存活的影響及免疫調(diào)控機制。方法1.不同雌激素濃度動物模型構(gòu)建評價及對脂肪移植物保留率的影響分別通過卵巢摘除(OVX組)、假手術(shù)(CON組)與皮下埋入17β-雌二醇藥片埋入(HE組),調(diào)控小鼠的雌激素水平45天,后行ELISA檢測小鼠血清雌激素水平;此時同時進行同體積自體脂肪移植手術(shù),在移植后不同時間點取材稱重,進行蘇木精-伊紅染色(HE)、免疫熒光觀察脂肪組織形態(tài)及組織學的結(jié)構(gòu)改變;RT-PCR進行移植物中雌激素受體α(ERα)的表達量。2.雌激素在脂肪移植中對炎癥細胞的募集調(diào)控、脂肪再生及組織中血管形成的影響從移植區(qū)取下的脂肪移植物進行膠原酶消化處理,提取SVF細胞進行流式細胞檢測中性粒細胞的含量、巨噬細胞進行亞型分類(促炎巨噬細胞Ml型及抗炎巨噬細胞M2型)的表達百分比、RT-PCR檢測相應(yīng)巨噬細胞分泌的炎癥因子(TNF-α及IL-10)及脂肪組織中非血源性干細胞的含量進行評估;基因芯片用于評估移植后一周的脂肪組織,并分析纖維化基因表達;組織免疫熒光及RT-PCR對血管化、干細胞增殖、分化能力進行評估。結(jié)果1.不同雌激素濃度動物模型構(gòu)建評價及對脂肪移植物保留率的影響(1)雌激素表達水平與移植前脂肪組織體積呈反比ELISA檢測小鼠血清雌激素濃度證實造模成功。HE組ERα表達量(3.07±1.1 pg/ml)為最高,而OXV組最低(3.07±l.lpg/ml)。造模45天后,低雌激素的小鼠脂肪墊重量要比其余兩組重2倍以上。(2)低水平雌激素可促進早期脂肪再生、肥大及雌激素受體的高表達脂肪移植后在第十二周,OVX組保留率最高。HE、免疫熒光結(jié)果顯示:低雌激素組比正常雌激素及高雌激素組,在移植后第一周,可見大量脂肪組織被破壞并出現(xiàn)明顯脂滴聚集,到第二周時就開始有豐富的多房脂肪細胞浸潤。十二周時,OVX組的脂肪細胞直徑明顯大于CON及HE組。ERα檢測發(fā)現(xiàn)OVX組早期表達是下降的,但第四周時表達升高到第十二周時為表達的高峰。2.雌激素在脂肪移植中對炎癥細胞的調(diào)控、脂肪再生及血管化的影響(1)高雌激素生理環(huán)境可導致炎癥細胞浸潤不足及M1往M2巨噬細胞轉(zhuǎn)換的異常在脂肪移植后急性炎癥反應(yīng)中,OVX組CDllb+粒細胞(中性粒細胞與單核巨噬細胞表面抗原)的浸潤最為強烈。這個現(xiàn)象與我們發(fā)現(xiàn)OVX組中早期細胞被炎癥破壞,油滴釋出,進而油囊產(chǎn)生的組織學表現(xiàn)相符合。第二周可見到OVX及CON兩組巨噬細胞表型開始從M1往M2巨噬細胞轉(zhuǎn)換,然而HE組早期Ml型局勢細胞浸潤缺乏,而第二周開始出現(xiàn)延遲的Ml浸潤。結(jié)果提示HE組在早期促炎巨噬細胞浸潤不足,從而導致早期壞死脂肪的破壞減弱及后期清除壞死組織的不足。(2)低雌激素在脂肪移植物纖維化的評估雖然在馬松染色中未見因強烈炎癥導致包膜的增厚,但在基因芯片的微點陣圖中顯示:脂肪移植早期在OVX組就可有脂肪組織纖維化基因表達的傾向。因此,可解釋在OVX組中脂肪纖維化的標志物膠原蛋白VI(COL-6)表達的增加。(3)在雌激素調(diào)控模型中早期血管生成水平與脂肪移植后的保留率不同步我們發(fā)現(xiàn)只有在正常雌激素濃度時移植物的血管化是最好。HE組在早期最高的血管化水平,但伴隨著脂肪組織的延遲壞死VEGF的表達量也隨之下降。然而,OVX組的早期血管化雖稍弱,但由于其充分的壞死吞噬與促炎信號提供與轉(zhuǎn)歸,為脂肪再生與肥大提供了適宜的微環(huán)境,最終獲得最高的保留率。(4)高雌激素對組織局部干細胞具有保護作用,但卻抑制了其脂肪細胞增殖、分化能力在實驗中觀察到HE組擁有大量的局部干細胞的表達,Ki67+表達量從第四周到第十二周呈現(xiàn)明顯增加的趨勢,但是PPAR-γ在第十二周時表達最低,因此我們認為HE組的脂肪分化與脂質(zhì)沉積受到抑制。結(jié)論1.通過卵巢摘除、植入雌激素藥片處理后,成功構(gòu)建模擬雌激素生理濃度的動物模型。2.卵巢摘除組中因低雌激素環(huán)境導致移植初期血管化無優(yōu)勢,但除了誘導脂肪細胞肥大之外,在卵巢摘除組移植早期大量募集中性粒細胞及M1巨噬細胞,及時浸潤清除壞死脂肪組織,為后期脂肪再生提供空間條件。3.在孕期高雌激素環(huán)境中,脂肪有較高含量的干細胞,并易于早期建立/保留血管化成分。但由于雌激素對干擾急性炎癥反應(yīng)及成脂的抑制作用,移植物的保留率低且出現(xiàn)中心壞死,提示高劑量的激素替代治療可能干擾脂肪移植的術(shù)后的保留率。此實驗為構(gòu)建的理想化模型,忽略小鼠年齡、性別差異及其他可能的荷爾蒙水平因素的干擾,然而通過分析在不同雌激素環(huán)境中脂肪移植物的存活機制,我們?yōu)榕R床研究提供更多的線索與更深入的理論依據(jù)。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R622
【圖文】：

同組的單側(cè)腹股溝脂肪墊的重量測量顯示ＯＶＸ脂肪重量較重（０．１９±０．０２ｇ，ｎ＝４）逡逑并且明顯重于ＨＥ組（０．０７±０．０２ｇ，ｎ＝４）邋（Ｐ＜０．０５）及ＣＯＮ組（０．１１±０．０２ｇ，ｎ＝４）逡逑（Ｐ邋＜０．０５），而ＨＥ組則為三組中重量最輕的脂肪組織（見圖１－１Ｂ）。在進行卵巢逡逑摘除及植入雌激素藥片４５天后，利用ＲＴ－ＰＣＲ檢測各組移植前腹股溝脂肪墊中雌逡逑激素受體ａ邋（ＥＲａ）量，ＯＶＸ組的表達量（０．４５士０．２）低于ＨＥ組（３．０７±ｌ．ｌ）（ｐ＜０．０５），逡逑結(jié)果顯示ＥＲａ的表達量與體循環(huán)雌激素的濃度成正比。逡逑Ａ邐Ｄ邐ＩＮＧＵＩＮＡＬ邋ＦＡＴ邋ＷＥＩＧＨＴ逡逑Ａ．邐Ｂ．逡逑＊逡逑０．２５－１邐＿邐＊邐＊邐■逡逑ＯＶＸ邋ＣＯＮ邋ＨＥ邐0２0＿邋丁逡逑１０＇１５＊邋ｖ逡逑０．０５－逡逑Ｉｎｇｕｉｎａｌ邋ｆａｔ邋ｐａｄｓ（ｌ邋ｍｏｎｔｈｓ邋ａｆｔｅｒ邋ｐｙａｒｊｅｃｔｐｍｙ，逡逑ｅｓｔｒｏｇｅｎ邋ｉｍｐｌａｎｔ邋ｏｒ邋ｓｈａｍ邋）邐0邋Ｉ邐

同組的單側(cè)腹股溝脂肪墊的重量測量顯示ＯＶＸ脂肪重量較重（０．１９±０．０２ｇ，ｎ＝４）逡逑并且明顯重于ＨＥ組（０．０７±０．０２ｇ，ｎ＝４）邋（Ｐ＜０．０５）及ＣＯＮ組（０．１１±０．０２ｇ，ｎ＝４）逡逑（Ｐ邋＜０．０５），而ＨＥ組則為三組中重量最輕的脂肪組織（見圖１－１Ｂ）。在進行卵巢逡逑摘除及植入雌激素藥片４５天后，利用ＲＴ－ＰＣＲ檢測各組移植前腹股溝脂肪墊中雌逡逑激素受體ａ邋（ＥＲａ）量，ＯＶＸ組的表達量（０．４５士０．２）低于ＨＥ組（３．０７±ｌ．ｌ）（ｐ＜０．０５），逡逑結(jié)果顯示ＥＲａ的表達量與體循環(huán)雌激素的濃度成正比。逡逑Ａ邐Ｄ邐ＩＮＧＵＩＮＡＬ邋ＦＡＴ邋ＷＥＩＧＨＴ逡逑Ａ．邐Ｂ．逡逑＊逡逑０．２５－１邐＿邐＊邐＊邐■逡逑ＯＶＸ邋ＣＯＮ邋ＨＥ邐0２0＿邋丁逡逑１０＇１５＊邋ｖ逡逑０．０５－逡逑Ｉｎｇｕｉｎａｌ邋ｆａｔ邋ｐａｄｓ（ｌ邋ｍｏｎｔｈｓ邋ａｆｔｅｒ邋ｐｙａｒｊｅｃｔｐｍｙ，逡逑ｅｓｔｒｏｇｅｎ邋ｉｍｐｌａｎｔ邋ｏｒ邋ｓｈａｍ邋）邐0邋Ｉ邐

Ａ），并且重量的保留率最好為５２％（０．００３±０．００１５％），而ＣＯＮ組移植物為逡逑肉粉色并且質(zhì)地細軟，其保留率則為２８％（０．００１６±０．０００５％），保留率最低的ＨＥ逡逑組為２２％邋（０．０００９５±０．０００５％）（戶＜０．０５）（見圖１－３，邋Ｂ）。這些移植物的重量不受逡逑到小鼠本身體重的影響。因此，我們實驗結(jié)果認為雌激素在自體脂肪移植中扮演逡逑者重要的角色。逡逑Ａ．邐Ｂ．逡逑ＯＶＸ邋ＣＯＮ邋ＨＥ逡逑１Ｗ邐一邐ＦＡＴ邋ＧＲＡＦＴ邋ＷＥＩＧＨＴ逡逑＾邋Ｏ．ＯＯ８－１邐＊逡逑ｒ，團網(wǎng)邐ｉ邐－ｃ0Ｎ逡逑２ｗＵＩＩ�。桑遥檫姡妫撸瑁邋义希模眩牛惯姡�。－逡逑ＣＯ邋0邋００２－逡逑６邋０．０００－１邋￣Ｉ邐１邐１邐１邐１—逡逑Ｕ邐１Ｗ邋２Ｗ邋４Ｗ邋８Ｗ邋１２Ｗ逡逑圖１－３腹股溝脂肪墊移植于小鼠頭皮下�？梢姡希郑亟M在第１２周時體積最大，呈黃白逡逑色并且觸感堅韌富有彈性，ＣＯＮ組則呈現(xiàn)條狀質(zhì)地柔軟的脂肪組織，ＨＥ組移植物重量逡逑最輕并且呈小而軟的脂肪組織（Ａ）。各組在不同時間點脂肪移植相對于體重的相對重逡逑量保留率（＊為邋ＯＶＸｖｓ．邋ＨＥ邋組；？＜０．０５）（＃為邋ＣＯＮｖｓ．ＨＥ邋組尸＜０．０５）邋（Ｂ）。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－３邋Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｆａｔ邋ｐａｄｓ邋ｕｎｄｅｒ邋ｔｈｅ邋ｓｃａｌｐ邋ｏｆ邋ｍｉｃｅ．邋Ａｔ邋ｗｅｅｋ邋１２，邋ｇｒａｆｔｓ邋ｉｎ邋ｔｈｅ逡逑ＯＶＸ邋ｇｒｏｕｐ邋ｌｏｏｋｅｄ邋ｙｅｌｌｏｗ邋ａｎｄ邋ｆｅｌｔ邋ｆｉｒｍ邋ａｎｄ邋ｒｅｓｉｌｉｅｎｔ．邋Ｈｏｗｅｖｅｒ

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本文編號：2770553