【摘要】：【目的】脊髓損傷(spinal cord injuries,SCI)是骨科一種嚴(yán)重的創(chuàng)傷性疾病,其發(fā)病率高,致殘率高,目前尚無有效治愈的方法。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)可促進(jìn)脊髓損傷的修復(fù),但體外培養(yǎng)的BMSCs細(xì)胞生物活性較低,對BMSCs進(jìn)行優(yōu)化以提高移植效果是研究的熱點(diǎn)。本研究旨在通過利用自主搭建的低強(qiáng)度脈沖超聲(Low intensity pulsed ultrasound,LIPUS)干預(yù)系統(tǒng),輸出不同強(qiáng)度超聲以激勵(lì)BMSCs,觀察細(xì)胞形態(tài)變化,檢測BMSCs增殖活性改變,得到LIPUS最佳干預(yù)優(yōu)化條件,獲得優(yōu)化LIPUS-BMSCs種子細(xì)胞;檢測LIPUS干預(yù)后BMSCs細(xì)胞凋亡以及神經(jīng)營養(yǎng)因子(Neurotrophic factors,NTFs)表達(dá)的改變,以研究LIPUS對BMSCs的激勵(lì)作用。移植優(yōu)化的LIPUS-BMSCs修復(fù)大鼠脊髓損傷(Spinal cord injury,SCI),評價(jià)細(xì)胞移植后大鼠的后肢運(yùn)動功能、組織形態(tài)結(jié)構(gòu)和損傷局部NTFs的表達(dá),探討LIPUS促進(jìn)BMSCs細(xì)胞移植修復(fù)SCI的機(jī)制。【方法】1.體外實(shí)驗(yàn)BMSCs的提取和培養(yǎng):從Wistar大鼠獲取BMSCs,全骨髓貼壁篩選法純化細(xì)胞,并進(jìn)行體外培養(yǎng)、擴(kuò)增。通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測CD29、CD90、CD34、CD45鑒定BMSCs。LIPUS超聲設(shè)備建立:自主搭建LIPUS細(xì)胞干預(yù)系統(tǒng),包括電源,信號發(fā)生器、信號放大器和超聲換能器,以超聲示波器檢測超聲波形和超聲強(qiáng)度。設(shè)定不同LIPUS干預(yù)強(qiáng)度激勵(lì)BMSCs,光鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)。通過檢測不同強(qiáng)度LIPUS干預(yù)下體外培養(yǎng)的BMSCs增殖活性的改變,確定最佳LIPUS干預(yù)條件。BMSCs細(xì)胞生物活性的檢測:TUNEL法檢測超聲干預(yù)后BMSCs的細(xì)胞凋亡狀態(tài)。蛋白免疫印跡法(Western blot,WB)法檢測NTFs表達(dá)量的變化。2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)動物模型建立和分組:36只Wistar大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、對照組、BMSCs移植組和LIPUS-BMSCs移植組,采用脊髓挫傷模型。大鼠SCI后7天,分別對BMSCs移植組、LIPUS-BMSCs移植組大鼠進(jìn)行BMSCs和LIPUS-BMSCs細(xì)胞移植。對照組大鼠注射DMEM/F12,假手術(shù)組大鼠脊髓暴露后不進(jìn)行脊髓挫傷,且不進(jìn)行細(xì)胞移植或培養(yǎng)液注射。細(xì)胞移植效果評價(jià):通過BBB量表評價(jià)假手術(shù)組、對照組、BMSCs移植組和LIPUS-BMSCs移植組大鼠的后肢運(yùn)動功能。各組取脊髓組織做HE染色、免疫熒光、ELISA,檢測脊髓組織結(jié)構(gòu)改變和損傷脊髓中心NTFs的表達(dá)�！窘Y(jié)果】1.LIPUS超聲干預(yù)系統(tǒng):本研究成功搭建LIPUS超聲干預(yù)系統(tǒng),可體外優(yōu)化BMSCs。檢測BMSCs增殖活性改變,確定LIPUS最佳干預(yù)強(qiáng)度為50mW/cm~2。2.細(xì)胞生物學(xué)活性:提取原代BMSCs細(xì)胞狀態(tài)良好,細(xì)胞鑒定證實(shí)第三代BMSCs純度在95%以上。LIPUS干預(yù)可提高BMSCs的增殖活性,而細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LIPUS干預(yù)后NTFs合成增加,其中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)和神經(jīng)生長因子(Nerve growth factor,NGF)的表達(dá)明顯增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.行為學(xué)評估:細(xì)胞移植后21天,BMSCs移植組、LIPUS-BMSCs移植組BBB評分高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。細(xì)胞移植后28天,BMSCs移植組和LIPUS-BMSCs移植組之間BBB評分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,LIPUS-BMSCs更好的促進(jìn)了大鼠后肢運(yùn)動功能的恢復(fù)。4.組織學(xué)觀察:細(xì)胞移植后,尤其是LIPUS-BMSCs移植組,脊髓空洞減小,脊髓灰質(zhì)內(nèi)組織結(jié)構(gòu)有所恢復(fù),神經(jīng)纖維存活增加,軸突增生活躍,反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞增生減少。ELISA檢測證實(shí)LIPUS-BMSCs細(xì)胞移植后,脊髓局部BDNF、NGF表達(dá)水平提高,其效果優(yōu)于BMSCs移植組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義�！窘Y(jié)論】本研究體外實(shí)驗(yàn)表明,利用自主搭建的LIPUS超聲干預(yù)系統(tǒng)激勵(lì)BMSCs可以提高細(xì)胞增殖活性,增加NTFs表達(dá),為細(xì)胞移植修復(fù)SCI提供了大量優(yōu)化的LIPUS-BMSCs種子細(xì)胞。BMSCs移植后,大鼠的運(yùn)動功能得到了改善,損傷脊髓局部組織結(jié)構(gòu)有所恢復(fù),NTFs表達(dá)提高,促進(jìn)了損傷脊髓的修復(fù)。同時(shí),LIPUS-BMSCs的效果明顯優(yōu)于BMSCs。實(shí)驗(yàn)證明LIPUS作為一種體外激勵(lì)方法可以在一定程度上提高BMSCs在SCI修復(fù)中的作用,且具有無創(chuàng)、安全的優(yōu)點(diǎn),為SCI修復(fù)的細(xì)胞移植的種子細(xì)胞優(yōu)化提供了新的手段。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R651.2
【圖文】：

大鼠BMSCs

BMSCs細(xì)胞鑒定

LIPUS超聲干預(yù)示意圖及設(shè)備圖

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本文編號：2765312