【摘要】：背景:創(chuàng)傷性腦損傷是神經(jīng)外科最常見的疾病,是主要的致死及致殘因素之一,但是目前臨床上尚沒有公認的診斷TBI的分子標志物,特別是輕度TBI因無明顯影像學改變,無明顯神經(jīng)系統(tǒng)定位體征,一直是臨床及法醫(yī)學鑒定的難點。有研究發(fā)現(xiàn)TBI可引起腦組織基因和蛋白質表達譜的變化,檢測體液中基因和蛋白質的表達變化發(fā)現(xiàn)其中部分與腦組織的損傷程度和臨床預后密切相關,因而這些損傷前后表達變化差異顯著的基因和蛋白質成為TBI潛在的生物標志物。miRNA是一類高度保守的單鏈RNA,血液中90%的miRNA以核酸-蛋白復合物形式存在,具有高度穩(wěn)定性和抗降解能力,且不隨個體差異、溫度、pH值、時間和酶的存在與否而變化,這些特點使體液miRNA可能成為理想的疾病標記物。蛋白質作為生命活動的執(zhí)行者和體現(xiàn)者,隨生命活動的進程表現(xiàn)出緊密而協(xié)調的變化,在TBI生物標志物的尋找過程中,也有不少研究者將目標聚焦于蛋白質。雖然已有不少候選生物標志物被提出,但由于重現(xiàn)性差,僅有少部分對具有影像學改變的中、重度TBI的診斷和預后判斷具有參考意義,至今尚未用于臨床診斷,而用于輕度TBI診斷的生物標志物迄今未見報道,同時上述候選生物標志物表達變化與TBI損傷機制及臨床預后的關系遠未闡明。本課題組前期應用2DE-MALDI-TOF/MS _3研究了大鼠輕度腦損傷后腦組織及血清蛋白質表達,確認了15個損傷前后表達差異的蛋白;應用生物信息學和網(wǎng)絡擾動等實驗方法,初步證實腦損傷相關基因水平和蛋白表達水平變化不一致很可能是通過miRNA抑制了基因的轉錄。目的:1.應用miRNA基因芯片和iTRAQ定量蛋白組學技術篩選TBI患者血漿中的生物標志物,并進行驗證及評價,以期尋找TBI臨床診斷客觀指標;2.應用生物信息學技術分析參與TBI后病理進程的生物過程及信號通路,為闡明其發(fā)病機理、尋找其治療靶點提供理論基礎。方法:1.樣本收集:按照標準收集輕度、中度、重度TBI患者以及健康對照人員血漿各30例;2.miRNA芯片:選取每組5例樣本應用miRNA芯片進行檢測,分析數(shù)據(jù),比較不同損傷程度TBI患者血漿樣本差異miRNA表達譜,應用生物信息學技術對差異miRNA的靶基因進行富集分析,篩選潛在的診斷分子標志物,然后應用RT-qPCR對這些miRNAs進行擴大樣本驗證,ROC曲線分析各miRNA診斷TBI的特異性和靈敏度;3.iTRAQ定量蛋白組學分析:將血漿樣本酶解后應用iTRAQ試劑進行標記,經(jīng)分離后行質譜檢測,然后對所得數(shù)據(jù)進行信息學分析,比較各組差異蛋白表達,并應用生物信息學技術對差異蛋白進行富集分析,應用ELISA對選取的差異蛋白及其上下游關鍵蛋白進行驗證,ROC曲線分析各蛋白診斷TBI的特異性和靈敏度。結果:1.受試者臨床特征:共有90名符合條件的TBI患者及30名健康志愿者納入研究。輕、中、重度TBI組及對照組各5例樣本進行miRNA芯片和iTRAQ檢測,輕_4、中、重度TBI組患者從受傷至采血時間分別為7.54±2.81h,6.08±0.79 h,6.16±1.19 h,各組間無統(tǒng)計學差異。輕、中、重度TBI組及對照組各25例進行后續(xù)驗證實驗,輕、中、重度TBI組患者從受傷至采血時間分別為7.22±1.75 h,7.16±1.57 h,6.53±1.56 h,各組間無統(tǒng)計學差異。2.miRNA芯片結果及驗證:(1)與對照組相比,輕、中、重度TBI組患者血漿分別有65,33和16個miRNAs表達上調,29,27和6個miRNAs表達下調。其中三組損傷組都有顯著改變的有13個miRNAs(其中7個上調,6個下調)。(2)miRNA靶基因GO富集分析結果顯示,輕度及中度TBI患者組出現(xiàn)10個共同的生物過程,而只有血管加壓素對全身動脈血壓的調節(jié)這一生物過程在輕、中、重度TBI組均出現(xiàn)。這些結果證明輕度及中度TBI可能具有相近的病理進程。(3)Pathway富集分析結果顯示,幾條重要的通路均參與輕、中、重度TBI的損傷進程,包括:p53信號通路、mTOR信號通路、TGF-beta信號通路、泡囊運輸中的誘捕相互作用、煙酸和煙酰胺代謝、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白信號通路。此外,兩種神經(jīng)生物學通路:泛酸鹽和CoA生物合成,長時程抑制則只出現(xiàn)在輕度TBI組的前15個通路中。(4)我們選擇芯片結果中與正常組血漿相比各損傷組患者血漿中均表達上調的miRNAs(miR-6867-5p,miR-3665,miR-328-5p,miR-762,miR-3195,miR-4669and miR-2861)進行qRT-PCR驗證。qRT-PCR驗證結果與芯片結果一致:與對照組相比,輕、中、重度TBI組患者血漿中7種miRNAs均顯著增高,重度TBI組中miR-3195,miR-328-5p表達水平比輕、中度TBI組顯著增高,重、中度TBI組中m_5iR-6867-5p表達水平比輕度TBI組顯著增高。(5)采用ROC曲線方法來計算ROC曲線下的面積,以評估這七個miRNAs診斷TBI的準確性。各miRNA的AUC值分別為:miR-6867-5p(0.854,P0.001),miR-3665(0.877,P0.001),miR-328-5p(0.888,P0.001),miR-762(0.916,P0.001),miR-3195(0.899,P0.001),miR-4669(0.907,P0.001),and miR-2861(0.913,P0.001)。所有miRNAs都顯示出良好的診斷準確性。(6)ROC分析這些miRNAs是否可以用于診斷輕度TBI(mTBI)。AUC值如下:miR-6867-5p(0.765,P0.001),miR-3665(0.916,P0.001),miR-328-5p(0.855,P0.001),miR-762(0.921,P0.001),miR-3195(0.859,P0.001),miR-4669(0.894,P0.001),and miR-2861(0.898,P0.001),所有這些miRNAs在鑒別輕度TBI患者時都具有一定的診斷準確率,其中miRNA-3665和miR-762在診斷輕度TBI患者時具有較好的診斷準確率。3.iTRAQ結果及驗證:(1)iTRAQ定量實驗共鑒定到5035條肽段和1109個蛋白。與健康對照組相比,輕度、中度和重度TBI組表達上調的蛋白數(shù)分別為90、92和103,表達下調的蛋白數(shù)分別為42、58和58。(2)差異蛋白的GO富集分析結果顯示,TBI損傷后差異蛋白更多與急性期反應,急性炎癥反應,損傷反應,應激反應,血小板活化,損傷修復,凝血等生物進程相關。其中輕度TBI和中度TBI組富集結果更加接近,而重度TBI的生物進程中脂質代謝相關的生物進程如甘油三酯分解代謝過程的調控,脂質分解過程的調節(jié),甘油三酯代謝過程的調控,甘油三酯代謝過程的正向調節(jié),排名相對比較靠前。(3)pathway富集分析結果顯示,三組_6 TBI均涉及到的信號通路有Hippo信號轉導途徑,補體與凝血級聯(lián)反應和沙門氏菌感染。(4)ELISA驗證補體級聯(lián)反應中Classical pathway和Lectin pathway中的關鍵蛋白分子C4、C4b、C3、C3b、C4BP、C5,結果顯示TBI后各損傷組C4、C4b表達水平均出現(xiàn)顯著上調(P0.05),且C4表達水平在輕、中、重度TBI組之間比較存在統(tǒng)計學差異(P0.05)。C3和C3b各組表達無明顯差異。C4BP作為該級聯(lián)通路的抑制性因子,三組不同損傷程度TBI組較正常對照組均出現(xiàn)顯著下調(P0.05)。同樣,C5表達水平在不同程度TBI組中均表達上調,且重度TBI組表達高于輕度TBI組(P0.05)。(5)采用ROC曲線分析評估C4,C4b和C5診斷TBI的準確性。ROC曲線下面積AUC值分別為:C4(0.882,P0.001),C4b(0.910,P0.001),C5(0.924,P0.001)。(6)ROC分析C4,C4b和C5診斷輕度TBI的準確性,AUC值如下:C4(0.779,P0.001),C4b(0.893,P0.001),C5(0.874,P0.001),C4b和C5在鑒定輕度TBI患者診斷準確率較高。結論:1.TBI患者血漿中miR-6867-5p,miR-3665,miR-328-5p,miR-762,miR-3195,miR-4669 and miR-2861可以作為TBI的診斷標志物。miR-3195和miR-328-5p兩種miRNAs可用于鑒別診斷輕、中度TBI和重度TBI。2.miRNA靶基因GO富集分析結果顯示,輕度及中度TBI患者組出現(xiàn)10個共同的生物過程,而只有血管加壓素對全身動脈血壓的調節(jié)這一生物過程在輕、中、重度TBI組均出現(xiàn)。3.miRNA Pathway富集分析結果顯示,幾條重要的通路均參與輕、中、重TBI的損傷進程,包括:p5_73信號通路、mTOR信號通路等。4.差異蛋白的GO富集分析結果顯示,TBI損傷后差異蛋白更多與急性期反應,急性炎癥反應,損傷反應,應激反應,血小板活化,損傷修復,凝血等生物進程相關。5.差異蛋白的pathway富集分析結果顯示,三組TBI均涉及到的信號通路有Hippo信號轉導途徑,補體與凝血級聯(lián)反應和沙門氏菌感染。6.通過差異miRNA和蛋白富集分析結果顯示,輕度TBI與中度TBI的病理過程更為接近,重度TBI則相對獨立。7.補體與凝血級聯(lián)反應通路在TBI中活化,重度TBI組的關鍵蛋白C4,C4b和C5表達明顯高于輕度和中度TBI組,提示其在重度TBI時活化程度更高。C4,C4b和C5可作為TBI的潛在診斷標志物,其中C4b和C5在鑒別輕度TBI時診斷準確率較高。
【圖文】：

圖 1-1 散點圖(輕度 TBI 組 VS 正常對照組)Fig. 1-1 ScatterPlot(mild TBI group VS control group)

圖 1-2 散點圖(中度 TBI 組 VS 正常對照組)Fig. 1-2 ScatterPlot(moderate TBI group VS control group)
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R651.15

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 齊斌;余麗梅;;microRNA概述及其研究進展[J];組織工程與重建外科雜志;2014年06期

2 劉丹丹;赫曉燕;;MicroRNA對動物生長發(fā)育的調節(jié)作用[J];畜禽業(yè);2009年10期

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本文編號：2672354