【摘要】：前言:骨肉瘤(osteosarcoma)是青少年中最常見的原發(fā)性骨惡性腫瘤之一,預(yù)后較差。目前臨床上對(duì)骨肉瘤的治療主要采用手術(shù)+化療等綜合治療,使得患者的五年生存率較以前得到顯著的提高。但是大劑量化療帶來的嚴(yán)重副反應(yīng)以及多藥耐藥等問題使得骨肉瘤的治療進(jìn)展收到限制。azurin就是近年發(fā)現(xiàn)的一種很有前途的抗腫瘤生物蛋白之一。近期的研究證實(shí)azurin在體外和荷瘤裸鼠體內(nèi)可選擇性的誘導(dǎo)某些黑色素瘤和人乳腺癌等腫瘤細(xì)胞凋亡,同時(shí)發(fā)現(xiàn)azurin在體內(nèi)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡時(shí),對(duì)機(jī)體無毒副作用。針對(duì)骨肉瘤容易產(chǎn)生化療耐藥的特點(diǎn),我們使用細(xì)菌氧化還原蛋白azurin處理骨肉瘤細(xì)胞U20S后發(fā)現(xiàn)其具有明顯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。而azurin的合成價(jià)格昂貴,我們通過基因工程的方式制備了表達(dá)azurin細(xì)菌株,通過摸索表達(dá)條件,達(dá)到最優(yōu)化效果。并利用重組的azurin蛋白,證實(shí)了其誘導(dǎo)凋亡的活性,并探索p53基因在骨肉瘤細(xì)胞中對(duì)azurin誘導(dǎo)的凋亡有何影響。研究目的:1.我們通過基因重組的方式將azurin的cDNA插入DH5α菌株,并證實(shí)其表達(dá)azurin蛋白。通過探索不同的細(xì)菌表達(dá)條件,摸索最佳條件已使其表達(dá)最大化。2.p53在azurin誘導(dǎo)的凋亡過程中具有重要的功能,我們嘗試使用具有不同p53基因的骨肉瘤細(xì)胞株來研究野生型和突變型p53是否影響azurin的抗腫瘤效果。3.通過使用基因干擾技術(shù),更準(zhǔn)確高效的探索p53基因與azurin之間是如何作用來產(chǎn)生抗腫瘤效果的。研究方法:1.我們使用已有的pqe30/azurin質(zhì)粒,該質(zhì)粒中含有azurin的cDNA,通過pGEM T質(zhì)粒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)將其轉(zhuǎn)染進(jìn)入DH5 α菌株。通過改變細(xì)菌孵育的溫度、時(shí)間以及誘導(dǎo)劑ITPG的濃度,探索最佳的表達(dá)條件;2.我們使用含有野生型p53的U20S細(xì)胞株以及含有突變型p53的MG-63細(xì)胞株來研究azurin對(duì)不同p53基因細(xì)胞的影響。我們通過使用已知作用濃度的azurin分別作用這兩個(gè)細(xì)胞株不同時(shí)間,通過MTT來檢測(cè)細(xì)胞存活,通過顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),通過電子顯微鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化,通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期改變,通過RT-PCR檢測(cè)凋亡相關(guān)基因表達(dá)以及通過western blot檢測(cè)凋亡蛋白的表達(dá)水平。以此來研究不同p53表達(dá)水平下azurin作用的變化;3.我們選擇具有野生型p53的U20S細(xì)胞株,使用構(gòu)建的p53 siRNA來干擾細(xì)胞內(nèi)p53的表達(dá),再次使用azurin作用細(xì)胞,檢測(cè)細(xì)胞周期,細(xì)胞形態(tài),凋亡相關(guān)蛋白等表達(dá),來定位azurin的作用靶點(diǎn)。研究結(jié)果:1.當(dāng)外界條件不變時(shí),使用pqe30/azurin質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的DH5α菌株在37攝氏度,0.8ug/ml的ITPG作用5小時(shí)后表達(dá)效率最高;2.由于MG-63細(xì)胞株為p53突變型,而U20S為野生型,因此在azurin作用后兩種有明顯差異。Azurin可以顯著誘導(dǎo)U20S發(fā)生凋亡,其凋亡相關(guān)的細(xì)胞形態(tài),超微結(jié)構(gòu)變化均被觀察到,同時(shí)細(xì)胞周期發(fā)生明顯變化,凋亡相關(guān)蛋白水平明顯上升,特別是與p53相關(guān)的Bax和Bcl-2的變化最為顯著。而在MG-63細(xì)胞中這些變化均不明顯。說明,p53可能在azurin誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡中是有重要作用的。但是,由于azurin是一種蛋白分子,其在細(xì)胞內(nèi)的作用較為復(fù)雜,因此需要更精確的研究來證實(shí)。于是,我們?cè)僖淮卧O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。3.我們通過使用p53 siRNA+azurin處理U20S細(xì)胞,由于p53 siRNA能且只能抑制p53基因的表達(dá),我們發(fā)現(xiàn)此時(shí)使用azurin處理后更多的細(xì)胞存活,較低的凋亡率,caspase-3活性、Bcl-2的上調(diào)程度、Bax的下調(diào)程度均低于對(duì)照組,即未使用p53 siRNA抑制組。在TUNEL檢測(cè)中,p53 siRNA+azurin處理后的細(xì)胞陽性率低于對(duì)照組。說明p53 siRNA可以抑制由azurin引起的凋亡。由于使用p53 siRNA為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù),隨著時(shí)間的推移,其功能會(huì)出現(xiàn)下降。因此我們觀察到在作用72小時(shí)后,再次出現(xiàn)凋亡相關(guān)的反應(yīng)。說明,azurin是和p53結(jié)合后才能發(fā)揮作用,它可以直接作用于上游而引發(fā)下游各相關(guān)產(chǎn)物的變化。研究還發(fā)現(xiàn)p53的調(diào)控細(xì)胞周期中可能出現(xiàn)類似癌基因的作用,而azurin的結(jié)合可以逆轉(zhuǎn)這一功能。結(jié)論:本研究通過使用RNA干擾技術(shù)精確的將azurin的作用靶點(diǎn)定位于p53基因,證實(shí)了其確實(shí)通過與p53結(jié)合產(chǎn)生作用,解釋了 azurin在一些細(xì)胞株上誘導(dǎo)凋亡作用較弱的原因,并發(fā)現(xiàn)p53在野生型細(xì)胞株中類似癌基因的作用,為進(jìn)一步探索腫瘤的發(fā)生及基因治療開拓道路。
【圖文】：

１．１邋？邋１．２邋ｐｑｅ３邋Ｏ／ａｚｕｒｉｎ邋質(zhì)粒逡逑含有ａｚｕｒｉｎｃＤＮＡ序列，由本研究小組制備、儲(chǔ)存。逡逑１．１．１．３邋ｐＧＥＭＴ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)購自Ｐｒｏｍｅｇａ．（圖１）逡逑２逡逑

通急
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R738.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2660035