【摘要】：研究背景與目的下腰痛(Low Back Pain,LBP)在臨床上較為常見,是門診患者就診的常見病因之一~([1])。下腰痛嚴重影響患者生活質(zhì)量,并且給社會和個人造成巨大的經(jīng)濟損失~([2])。目前,如腰椎間盤突出癥、腰椎管狹窄癥及退變性側(cè)凸等,被公認的是引起下腰痛主要疾病。通過大量的研究證實,這些疾病均與椎間盤退變(Intervertebral DiscDegeneration,IDD)及其繼發(fā)的病理改變有關(guān)~([3])。下腰痛在我國的發(fā)病率逐年加劇,隨著社會老齡化,腰椎退變性疾病患者亦呈遞增趨勢。目前在臨床上,針對椎間盤疾病,最主要的治療手段仍然是手術(shù)治療~([4])。手術(shù)治療可以有效的緩解臨床癥狀,但是手術(shù)并不能從根本上修復(fù)已經(jīng)退變的椎間盤,并且有可能產(chǎn)生嚴重并發(fā)癥,給病人帶來更大的痛苦。因此對椎間盤退變機制及生物治療的深入研究具有十分重要現(xiàn)實意義。椎間盤的解剖結(jié)構(gòu)分為,中央的髓核、外側(cè)的纖維環(huán)及上下兩端的終板構(gòu)成;椎間盤的主要功能為維持正常的脊柱結(jié)構(gòu),承擔(dān)脊柱的生物應(yīng)力~([5])。髓核組織正常的含水量為椎間盤發(fā)揮生理功能、承擔(dān)應(yīng)力的必要前提,椎間盤退變早期的影像學(xué)表現(xiàn),即為MRI下T2加權(quán)像上髓核組織含水量減少,由高信號逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榈托盘柹踔翢o信號~([6])。而含水量的減少,目前認為是由于細胞外基質(zhì)的破環(huán)導(dǎo)致。含水量減少引起椎間高度降低,局部運動節(jié)段不穩(wěn),最終導(dǎo)致髓核突出,神經(jīng)根管狹窄等病理變化從而壓迫局部神經(jīng)引起腰痛~([7])。目前不少針對椎間盤退變的臨床研究都是根據(jù)其影像學(xué)上髓核含水量的變化來判斷椎間盤退變進程的~([8]),這也是臨床工作中判斷椎間盤退變的重要指標之一。研究表明,椎間盤髓核細胞凋亡增加,炎癥因子的大量侵入,髓核中細胞外基質(zhì)(Extracelluar matrix,ECM)的代謝紊亂等是導(dǎo)致其發(fā)生退變的主要原因。大量研究結(jié)果證明,而在這些原因之中,髓核細胞外機制合成分解代謝紊亂被認為是最主要的引起椎間盤退變的機制~([9])。NP細胞在ECM代謝中起著關(guān)鍵作用,可分為兩個方面。關(guān)于合成代謝,ECM的主要成分是Ⅱ型膠原(COL-Ⅱ)和蛋白多糖~([10])。蛋白聚糖是必不可少的椎間盤的蛋白多糖的組成部分,與大量的硫酸化糖胺聚糖(sGAG)側(cè)鏈~([11]);這些分子使椎間盤具有凝膠特性,使其保持水分和機械支持能力。這些基質(zhì)基因在IDD的表達下降已被研究者報告,表明在IDD中合成代謝的減少~([12,13])。在分解代謝方面,以往的研究表明基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)和聚蛋白多糖酶(ADAMTS)在IDD中上調(diào),這是IDD中ECM降解的主要原因。近年來,再生醫(yī)學(xué)以及生物治療,成為研究熱點~([14])。對于椎間盤退變的生物治療和再生醫(yī)學(xué)的相關(guān)研究,也聚焦于具有修復(fù)及多向分化潛能的干細胞身上。該類治療方法通過注射等手段,將具有修復(fù)能力的干細胞直接作用于退變的椎間盤組織,促進椎間盤內(nèi)細胞數(shù)量的恢復(fù)以及基質(zhì)的再生,最終起到改善退變,甚至逆轉(zhuǎn)退變進程的治療效果~([15])。目前,針對椎間盤退變的再生治療手段,以間充質(zhì)干細胞為主。間充質(zhì)干細胞具有多向分化潛能、組織替代、調(diào)控微環(huán)境、影響局部免疫及炎癥反應(yīng)等特性,同時間充質(zhì)干細胞來源多樣,不同來源間多能性存在差異等特性。間充質(zhì)干細胞相關(guān)的再生治療的研究非常廣泛,并且取得了很多積極的結(jié)果,然而間充質(zhì)干細胞治療存在來源獲取難、細胞易衰老、具有潛在致瘤性等弊端,極大地限制了間充質(zhì)干細胞的再生醫(yī)學(xué)研究及應(yīng)用。所以,基于干細胞治療的局限性,更多的研究者將目光投向間充質(zhì)干細胞所分泌產(chǎn)生的一種物質(zhì)——外泌體上。外泌體是由細胞分泌的納米級囊泡,囊泡內(nèi)包含編碼RNA,非編碼RNA,蛋白質(zhì),抗原遞呈因子,以及DNA~([16,17])。由于其具有雙層膜結(jié)構(gòu),能夠很容易地穿透細胞膜達到將內(nèi)容物進行細胞間轉(zhuǎn)導(dǎo)的效果,通過傳遞蛋白質(zhì)和RNA,外泌體可以調(diào)節(jié)受體細胞和其他器官的功能、活動~([18])。JCI也于2016年做專刊對外泌體的發(fā)現(xiàn)、作用以及對未來應(yīng)用上的展望做了系統(tǒng)綜述。目前,外泌體的再生效應(yīng),已經(jīng)在其他組織和器官損傷修復(fù)的研究中得到驗證,包括心臟損傷治療、肺部損傷治療、肝臟再生治療、骨折愈合、腦卒中后再生治療等~([19,20])。但是間充質(zhì)干細胞外泌體能夠促進椎間盤退變的修復(fù),其效果與干細胞治療相比優(yōu)勢如何等,目前仍在研究階段,僅有少量報道。因此本課題針對上述情況,擬對間充質(zhì)干細胞來源外泌體在椎間盤髓核細胞退變過程中的作用進行系統(tǒng)研究,力求通過該研究發(fā)現(xiàn)治療椎間盤退變的新的手段,為今后的再生醫(yī)學(xué)相關(guān)治療研究打下基礎(chǔ)。第一部分:間充質(zhì)干細胞外泌體的分離與鑒定方法:采集非開放性股骨骨折外傷患者股骨內(nèi)的新鮮骨髓標本,按照Percoll密度梯度離心方法,分離和收集有核細胞,在5%的CO_2和37℃條件下,使用含15%胎牛血清的DMEN培養(yǎng)基靜止培養(yǎng),細胞達90%融合時可以傳代。利用流式細胞術(shù)、以及誘導(dǎo)分化,鑒定干細胞特性。細胞傳代至P2代后,將間充質(zhì)干細胞接種于T75以上培養(yǎng)瓶中進行擴增,待細胞融合度達到90%時,更換低外泌體血清培養(yǎng)基,每2天換液收集培養(yǎng)基,連續(xù)收集,對收集到的培養(yǎng)基使用超速離心機多次離心,抽提外泌體。對收集到的外泌體,使用電鏡掃描及Nanosight分析外泌體的性狀,使用Western Blot,檢測外泌體中特定的蛋白表達情況,使用融合試驗明確外泌體的融合能力。結(jié)果:成功培養(yǎng)出狀態(tài)良好的骨髓來源間充質(zhì)干細胞7例。流式細胞試驗測得CD29、CD90~+、CD44~+,CD105~-、CD14~-,CD34、CD45不表達等干細胞標志物,證明所得細胞符合國際標準。將原代細胞進行成骨及成脂誘導(dǎo),原代細胞中顯示出明顯的鈣結(jié)節(jié)及脂肪滴,證明其多項分化潛能。細胞傳代至P2代后,用低外泌體血清培養(yǎng)基大量培養(yǎng)并收集上清,用超速離心法收集抽提外泌體。用Western Blot方法檢測收集到的外泌體中CD81及CD63的表達情況,同時Nanosight及電鏡檢測外泌體的大小形態(tài)及純度,證明所收集得到的確定為純度較高的外泌體。將所得外泌體用PKH67染料染色并加入到MSC中,結(jié)果顯示外泌體可將MSC染色,證明其膜融合能力。結(jié)論:完成骨髓間充質(zhì)干細胞的原代培養(yǎng),并通過相關(guān)試驗驗證,所獲細胞符合間充質(zhì)干細胞國際標準。傳至P2代后,更換使用低外泌體血清培養(yǎng)基并收集,用超速離心的方法抽提外泌體,并驗證其確為外泌體。第二部分:MSC外泌體對退變椎間盤的作用方法:根據(jù)試驗設(shè)計,收集滿足條件的人髓核組織進行原代培養(yǎng)。通過CCK-8增殖試驗,驗證所得外泌體是否存在細胞毒性,以及其促進髓核細胞增殖能力。試驗分組:設(shè)對照組為超速離心后的上清液作為去外泌體上清作組;設(shè)陰性對照組為HEK293細胞按照上述方法培養(yǎng)并收集上清進行超速離心收集得到的外泌體;設(shè)空白對照組為超速離心后未培養(yǎng)過細胞的原始培養(yǎng)基;設(shè)實驗組為間充質(zhì)干細胞來源外泌體組。測定各樣本蛋白量,將不同濃度的樣品加入髓核細胞中,培養(yǎng)24h后,使用Western Blot、PCR以檢測處理后細胞外基質(zhì)分泌表達情況。同上述方法處理,驗證與髓核細胞外基質(zhì)降解相關(guān)MMP、ADAMTS的表達情況,以及髓核細胞外基質(zhì)合成相關(guān)基因的表達情況。使用高通量測序技術(shù),找尋靶基因,分析外泌體對髓核細胞體外退變過程的影響。結(jié)果:成功建立體外髓核細胞系5株。通過增殖試驗證明MSC外泌體對NP細胞不僅沒有細胞毒性,試驗結(jié)果同時還證明MSC外泌體還具備提高髓核細胞增殖的能力。分組處理后,通過Western Blot、PCR等試驗方法驗證,實驗組的髓核細胞較對照組及陰性對照組中,2型膠原、蛋白聚糖表達量顯著上調(diào),分解代謝相關(guān)MMP1、MMP2、MMP7表達雖然沒有顯著下調(diào),但是合成相關(guān)的ACAN、COLII、CHSY表達顯著上調(diào)。高通量轉(zhuǎn)錄組測序,證明MSC外泌體處理后NP細胞轉(zhuǎn)錄組水平基因表達與對照組相比存在顯著差異。結(jié)論:獲得正常人髓核細胞系5株。增殖試驗證明MSC外泌體對NP細胞不具備細胞毒性,同時具有提高NP細胞增殖的能力。分組定量處理細胞,并使用Western Blot、PCR方法檢測,發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細胞來源外泌體具有促進細胞外基質(zhì)合成,上調(diào)髓核細胞細胞外基質(zhì)合成酶以及下調(diào)細胞外基質(zhì)降解酶的表達。第三部分:MSC外泌體上調(diào)HO-1影響椎間盤退變的機制研究方法:(1)根據(jù)高通量RNA測序結(jié)果篩選候選靶基因。(2)結(jié)合MSC外泌體高通量miRNA測序數(shù)據(jù),利用生物信息學(xué)分析MSC外泌體中miRNA成分對靶基因的影響。(3)篩選與BACH1結(jié)合的、MSC外泌體處理后高表達的miRNA,并對結(jié)合進行驗證。(4)研究篩選出的miRNA對BACH1、HO-1表達的影響。(5)明確MSC外泌體通過microRNA對突變BACH1的結(jié)合位點的影響。結(jié)果:(1)MSC外泌體處理后,NP細胞低氧相關(guān)基因表達存在明顯差異。(2)MSC外泌體能夠顯著上HO-1表達,而HO-1抑制性BACH1的表達則顯著下調(diào)。進一步的miRNA測序數(shù)據(jù)顯示MSC來源外泌體中高峰度miRNA均與BACH1存在相互作用,提示其功能可能通過抑制BACH1來發(fā)揮。(3)通過miRNA實時定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)外泌體處理后的髓核細胞其BACH1抑制性miR-21、-23、-125、-let7均出現(xiàn)明顯上調(diào)。(4)利用miRNA模擬物進行miRNA過表達,結(jié)果顯示上述候選miRNA均能不同程度抑制BACH1表達。(5)MSC外泌體中miR-21、-23、-125、-let7能夠直接抑制BACH1的表達,促進HO-1表達,影響椎間盤退變。結(jié)論:證實MSC外泌體促進IDD中ECM合成的作用,是通過miRNA等轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子來實現(xiàn)。證實對BACH1存在抑制性的miR-21、-23、-125、-let7,在MSC外泌體處理后上調(diào),發(fā)現(xiàn)了外泌體上調(diào)HO-1的作用機制。小結(jié)本研究首次發(fā)現(xiàn)了外泌體中所含有的BACH1靶向性miRNA因子能夠改善椎間盤退變。我們發(fā)現(xiàn)了miR-21、-23、-125、-let7在外泌體處理后的髓核細胞中表達顯著上調(diào),而通過功能學(xué)驗證明確了上述miRNA確實能夠引起B(yǎng)ACH1表達的變化,從而引起HO-1活性的增高,促進椎間盤退變的修復(fù)。通過上述研究啟發(fā)了關(guān)于HO-1的調(diào)控機制。在前期針對HO-1修復(fù)椎間盤退變的基礎(chǔ)進一步通過MSC來源外泌體豐富了HO-1的調(diào)控機制,此外也通過該研究進一步證明了MSC來源外泌體促進椎間盤修復(fù)的機制。
【圖文】：

分離、收集有核細胞進行原代培養(yǎng)。1天后顯微鏡下可觀察到少量梭形小細胞貼壁生長。而后繼續(xù)可觀察到典型的細胞形態(tài)和細胞集落，與國際標準一致。細胞多次傳代后骨髓MSC出現(xiàn)現(xiàn)衰老傾向。本課題組選用P2代進行試驗研究，見圖1-1。圖1-1 相差顯微鏡下觀察P2、P4、P6的骨髓MSC細胞生長情況(200X)。（二）骨髓MSC性質(zhì)鑒定

CD34、CD45 不表達，符合國際標準，證明確為骨髓 MSC，見圖 1-2。圖1-2 流式細胞學(xué)檢測MSC表面標記物然后驗證其多向分化潛能。成骨誘導(dǎo)10天、21天，茜素紅染色，MSC中可見明顯的鮮紅色團塊，證明出現(xiàn)鈣質(zhì)沉積，提示細胞已誘導(dǎo)分化為具有骨質(zhì)沉積的骨前體細胞。成脂誘導(dǎo)10天、21天后，油紅O染色30min，MSC中內(nèi)出現(xiàn)染為紅色的脂滴，，證明MSC細胞已誘導(dǎo)分化為脂肪前體細胞。圖1-3 細胞染色鑒定MSC誘導(dǎo)分化情況，上為成骨誘導(dǎo)后茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色情況（200X），下為成脂肪誘導(dǎo)后細胞內(nèi)脂肪滴染色（400X
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R681.5

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 嚴冰浩;張燕;方碩;王越;劉厚奇;;間充質(zhì)干細胞來源的外泌體的制備方法及應(yīng)用[J];解剖學(xué)雜志;2016年05期

2 阿諾得 卡普蘭;廖聯(lián)明;王萍;譚建明;;間充質(zhì)干細胞更改名稱的時候到了[J];中華細胞與干細胞雜志(電子版);2017年05期

3 邱坤銀;廖雄宇;郭淑儀;祁皓寧;藍菁菁;方建培;黃科;黎陽;徐宏貴;周敦華;;間充質(zhì)干細胞治療兒童難治性遲發(fā)性出血性膀胱炎療效和安全性的臨床研究[J];中國實驗血液學(xué)雜志;2018年03期

4 陳俊秋;黃梁滸;;間充質(zhì)干細胞及其外泌體促血管再生的分子機制研究進展[J];中國實驗血液學(xué)雜志;2018年06期

5 賴秀藍;馬廉;;間充質(zhì)干細胞的臨床應(yīng)用及產(chǎn)業(yè)化前景[J];中國小兒血液與腫瘤雜志;2016年06期

6 申曉靖;劉海蓉;劉新燕;趙鵬;鄭建金;盧恕來;王超;;阿司匹林影響人牙髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的新型藥理研究[J];中國醫(yī)學(xué)前沿雜志(電子版);2017年01期

7 陶一昕;馬鋼;;皮膚間充質(zhì)干細胞的研究進展[J];中國科學(xué):生命科學(xué);2017年04期

8 湯沈力;譚秋雯;周宇婷;呂青;;脂肪間充質(zhì)干細胞在皮膚創(chuàng)傷修復(fù)中的研究進展[J];中國修復(fù)重建外科雜志;2017年06期

9 徐麗;唐葉丹;丁迎春;;臍帶間充質(zhì)干細胞治療移植物抗宿主病患者的護理[J];護理學(xué)雜志;2017年11期

10 袁林;曹依娜;楊征毅;孫晉;潘廣嗣;錢鈞;宋晶晶;王涵;;人頜骨間充質(zhì)干細胞的外泌體在巨噬細胞調(diào)控中的作用[J];實用口腔醫(yī)學(xué)雜志;2017年03期

相關(guān)會議論文 前10條

1 白雪;霍波;;面積約束情況下形狀對間充質(zhì)干細胞分化的影響[A];第十一屆全國生物力學(xué)學(xué)術(shù)會議暨第十三屆全國生物流變學(xué)學(xué)術(shù)會議會議論文摘要匯編[C];2015年

2 李坦;劉卓;徐運;;人臍帶間充質(zhì)干細胞治療脊髓小腦共濟失調(diào)3型的研究[A];中華醫(yī)學(xué)會第十八次全國神經(jīng)病學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編（上）[C];2015年

3 陳可;王丁;韓之波;朱德林;韓忠朝;;人臍帶間充質(zhì)干細胞體外發(fā)揮免疫活性的研究[A];第12屆全國實驗血液學(xué)會議論文摘要[C];2009年

4 金明順;張毅;賈秀芬;周燕華;閆妍;劉慧雯;;小鼠脂肪間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)以及多潛能分化的研究[A];中國解剖學(xué)會第十一屆全國組織學(xué)與胚胎學(xué)青年學(xué)術(shù)研討會論文匯編[C];2009年

5 張彥;李尚珠;;間充質(zhì)干細胞在血管工程中的機制及應(yīng)用[A];2009全國中西醫(yī)結(jié)合周圍血管疾病學(xué)術(shù)交流會論文集[C];2009年

6 石玉;戴\戎;;周期性拉應(yīng)力對間充質(zhì)干細胞分化影響的研究[A];第九屆全國生物力學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2009年

7 黎嬌;朱爭艷;杜智;駱瑩;王鵬;高英堂;;人臍帶間充質(zhì)干細胞分泌物對肝細胞增殖和凋亡的影響[A];天津市生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會第30次學(xué)術(shù)年會暨生物醫(yī)學(xué)工程前沿科學(xué)研討會論文集[C];2010年

8 余慧;黃紅云;陳琳;王洪美;;生物反應(yīng)器培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞的研究現(xiàn)狀[A];中國醫(yī)師協(xié)會神經(jīng)外科醫(yī)師分會第六屆全國代表大會論文匯編[C];2011年

9 覃永亮;曾慧蘭;卜欠欠;鐘啟;韓新愛;;尼古丁誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細胞凋亡的機制研究[A];第13屆全國實驗血液學(xué)會議論文摘要[C];2011年

10 喬淑敏;陳廣華;王易;吳德沛;;人臍帶間充質(zhì)干細胞超微結(jié)構(gòu)觀察[A];中華醫(yī)學(xué)會第十七次全國兒科學(xué)術(shù)大會論文匯編（下冊）[C];2012年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 本報記者 劉艷芳;牙髓間充質(zhì)干細胞填補了干細胞研究的空白[N];廣東科技報;2017年

2 上海生科院 上海交大醫(yī)學(xué)院健康科學(xué)研究所 曹楷;間充質(zhì)干細胞：干細胞中的孫悟空[N];上海科技報;2014年

3 第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院輸血科 李忠俊 整理 吳劉佳;間充質(zhì)干細胞研究又見新方法[N];健康報;2013年

4 劉道安;細胞產(chǎn)品國家工程研究中心啟用間充質(zhì)干細胞庫[N];健康報;2007年

5 記者　陳建強;首家間充質(zhì)干細胞庫在津建成[N];光明日報;2006年

6 南方日報記者 嚴慧芳;選擇干細胞儲存須謹慎[N];南方日報;2016年

7 記者 李素鋒;我市首例間充質(zhì)干細胞移植手術(shù)取得成功[N];臨汾日報;2009年

8 馮國梧;全球首個臍帶間充質(zhì)干細胞庫規(guī)�；\營[N];科技日報;2008年

9 劉瑩清;全球首個臍帶間充質(zhì)干細胞庫泰達規(guī)模運營[N];北方經(jīng)濟時報;2008年

10 姜明;全球首個臍帶間充質(zhì)干細胞庫實現(xiàn)規(guī)模運營[N];工人日報;2008年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 韓兵;脂肪來源間充質(zhì)干細胞旁分泌因子抗病理性瘢痕成纖維細胞纖維化的作用及分子機制的研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2018年

2 郝曉燕;我國小麥生產(chǎn)區(qū)位集聚：特征、影響因素及增長效應(yīng)[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2019年

3 陳朝杰;設(shè)計創(chuàng)新驅(qū)動國家發(fā)展[D];廣東工業(yè)大學(xué);2018年

4 亓立峰;臍帶間充質(zhì)干細胞及細胞因子共移植治療腦損傷的分子機理研究[D];山東大學(xué);2018年

5 馬彩云;間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)分化為肺泡Ⅱ型上皮細胞修復(fù)肺損傷研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2018年

6 何遠;遺傳性壓力易感性神經(jīng)病家系臨床與基因分析研究[D];武漢大學(xué);2016年

7 朱凌燕;as-microRNA-205-5p修飾的間充質(zhì)干細胞在糖尿病足治療中的作用及機制研究[D];南昌大學(xué);2017年

8 熊q

本文編號：2649496