【摘要】：研究背景:近年來(lái),由于生活方式的改變和生存環(huán)境的惡化,我國(guó)各種肝臟疾病發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。目前,多種良惡性肝臟疾病的治療方法最有效的仍然是肝部分切除術(shù),但是切除過(guò)大有可能出現(xiàn)肝功能衰竭,切除過(guò)小則會(huì)引起腫瘤復(fù)發(fā)或者不能完全根治肝臟疾病。然而,肝臟與其它臟器不同的是,它具有一定的再生能力。所以,用什么方法可以加快肝細(xì)胞增殖的速率成為近年來(lái)肝膽科的研究重點(diǎn)。但是,目前研究最多的是怎樣利用藥物保護(hù)肝功能,避免肝衰竭,而對(duì)其再生機(jī)制的研究甚少。如果能夠闡明肝再生的機(jī)制,則可以控制其中抑制增殖的環(huán)節(jié),從而加快肝再生速率,使肝衰竭的患者迅速恢復(fù)肝功能。但是,肝部分切除術(shù)后肝臟再生的機(jī)制非常復(fù)雜,不是單個(gè)肝臟實(shí)質(zhì)器官的再生,而是由于肝切除術(shù)后引起的全身各個(gè)系統(tǒng)的應(yīng)激反應(yīng),包括各種細(xì)胞因子,免疫因子,炎癥因子,以及體內(nèi)多種離子,多個(gè)臟器的共同參與。這是研究肝再生機(jī)制的難點(diǎn)。Tmub1是近年來(lái)在研究肝細(xì)胞增殖的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的一種含有泛素樣結(jié)構(gòu)域的核-胞漿穿梭蛋白,在正常肝臟的肝細(xì)胞內(nèi)主要位于細(xì)胞漿中,它包含有1個(gè)類似泛素結(jié)構(gòu)的區(qū)域,在增殖周期中,它可以穿梭于細(xì)胞漿和細(xì)胞核之間,Tmub1蛋白在肝細(xì)胞增殖期逐漸向細(xì)胞核內(nèi)穿梭,在增殖后期,則幾乎全部穿梭進(jìn)入細(xì)胞核[1-5]。細(xì)胞增殖期,細(xì)胞核內(nèi)的主要活動(dòng)是DNA的復(fù)制和姐妹染色體的分離,所以Tmub1蛋白應(yīng)該在細(xì)胞核內(nèi)參與了細(xì)胞增殖的過(guò)程,但是具體的機(jī)制目前尚不清楚。Securin即分離酶抑制蛋白,是參與細(xì)胞周期調(diào)控的重要物質(zhì),質(zhì)量約22KD,由202個(gè)氨基酸殘基組成,在多種腫瘤中高表達(dá)[6,7]。在正常的增殖細(xì)胞核內(nèi),粘著蛋白復(fù)合體使兩條姐妹染色單體相連,活化的分離酶將粘著蛋白復(fù)合體分解后,姐妹染色單體分離[7]。securin通過(guò)抑制分離酶的活化,從而抑制染色體過(guò)早分離,在有絲分裂后期,securin蛋白N末端的毀壞盒與后期促進(jìn)復(fù)合物連接,并在多種酶類參與下被泛素化降解,從而使分離酶活化。securin參與了有絲分裂,凋亡,細(xì)胞周期的進(jìn)程以及DNA的修復(fù)等關(guān)鍵的細(xì)胞活動(dòng)[7]。我們從結(jié)構(gòu)上分析,tmub1蛋白內(nèi)有泛素樣結(jié)構(gòu)域,而securin蛋白可以與泛素結(jié)合,也就是說(shuō)securin蛋白有泛素結(jié)合域,所以tmub1蛋白可與securin蛋白結(jié)合。tmub1蛋白在g1期幾乎完全表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)內(nèi),而當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入g2期則大量穿梭進(jìn)入細(xì)胞核,而此時(shí)正是增殖細(xì)胞的有絲分裂準(zhǔn)備期[3-5]。因此,tmub1蛋白與securin蛋白同時(shí)具有結(jié)構(gòu)以及空間的的可結(jié)合性。所以,如果能夠證明肝部分切除術(shù)后肝細(xì)胞增殖的過(guò)程中tmub1蛋白能夠與securin結(jié)合,并且能夠影響肝細(xì)胞的增殖進(jìn)程,將對(duì)我們今后預(yù)防和治療肝切除術(shù)后肝功能衰竭具有重要的意義,并且對(duì)其它器官及細(xì)胞的增殖研究也有重要的借鑒作用。研究目的:1.證實(shí)肝部分切除術(shù)后tmub1蛋白能夠與securin蛋白結(jié)合。2.明確tmub1蛋白在肝細(xì)胞增殖中的作用。材料方法:1.(1)建立大鼠70%的肝切除模型,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)采用40只大鼠隨機(jī)分為5組,每組8只,第一組行肝切除術(shù)后直接灌注肝臟并取原代肝細(xì)胞,其余4組首先行肝部分切除術(shù),分別于術(shù)后12,24,48,72h灌注肝臟并取原代肝細(xì)胞。(2)提取原代肝細(xì)胞tmub1蛋白和securin蛋白。(3)其中一部分首先進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn),然后進(jìn)行western-blot實(shí)驗(yàn)了解tmub1蛋白與securin蛋白的結(jié)合及其隨肝切除術(shù)后時(shí)間的變化趨勢(shì);另外一部分直接進(jìn)行western-blot實(shí)驗(yàn),了解細(xì)胞內(nèi)tmub1的變化趨勢(shì)。2.(1)構(gòu)建過(guò)表達(dá)tmub1慢病毒載體及陰性空載體對(duì)照。(2)構(gòu)建沉默tmub1慢病毒載體及陰性空載體對(duì)照。3.(1)分別使用沉默tmub1慢病毒載體、過(guò)表達(dá)慢病毒載體及對(duì)應(yīng)的空載體轉(zhuǎn)染大鼠brl-3a肝細(xì)胞系,得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。(2)轉(zhuǎn)染后行流式細(xì)胞術(shù)及mtt檢測(cè)細(xì)胞周期,各組間細(xì)胞周期進(jìn)行對(duì)比,了解tmub1蛋白對(duì)肝細(xì)胞增殖的作用。結(jié)果:1.建立了的穩(wěn)定的大鼠70%肝切除模型。2.通過(guò)co-ip技術(shù)證實(shí)tmub1蛋白和securin間相互結(jié)合。免疫共沉淀后進(jìn)行western-blot得到蛋白條帶顯示tmub1蛋白與securin蛋白在肝切除術(shù)后相互結(jié)合。從條帶的結(jié)果看,在肝切除術(shù)后0h條帶灰度值較低,隨著切除術(shù)后時(shí)間增加逐漸增強(qiáng),到48h最高,72h再次下降。3.術(shù)后Tmub1蛋白western-blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)肝切除術(shù)后各時(shí)相點(diǎn)Tmub1蛋白含量未發(fā)生明顯改變。直接Tmub1蛋白western-blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)術(shù)后各時(shí)相點(diǎn)條帶亮度基本相同,IMAGE J圖像分析軟件分析各組每個(gè)灰度值,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,術(shù)后各時(shí)相點(diǎn)Tmub1蛋白含量無(wú)顯著差異(p0.05)。4.成功構(gòu)建了過(guò)表達(dá)Tmub1慢病毒載體、陰性空載體對(duì)照及沉默Tmub1慢病毒載體、陰性空載體對(duì)照。5.通過(guò)LV-Tmub1、LV-Tmub1陰性空載體對(duì)照及LV-Tmub1-RNAi、LV-Tmub1-RNAi陰性空載體對(duì)照轉(zhuǎn)染各組細(xì)胞與正常生長(zhǎng)的BRL-3A細(xì)胞組提取總蛋白,western-blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)組Tmub1蛋白條帶明顯增強(qiáng),而沉默組條帶明顯減弱,IMAGE J圖像分析軟件分析各組每個(gè)灰度值,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,過(guò)表達(dá)組Tmub1蛋白條帶與沉默組條帶差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01),其它各組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。6.MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖將LV-Tmub1、LV-Tmub1陰性空載體對(duì)照及LV-Tmub1-RNAi、LV-Tmub1-RNAi陰性空載體對(duì)照轉(zhuǎn)染各組細(xì)胞與正常生長(zhǎng)的BRL-3A細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后,進(jìn)行MTT比較,通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)各組OD值,發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)Tmub1慢病毒載體轉(zhuǎn)染的肝細(xì)胞OD值明顯高于沉默Tmub1慢病毒載體轉(zhuǎn)染的肝細(xì)胞。7.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期通過(guò)Tmub1過(guò)表達(dá)慢病毒載體(LV-Tmub1)、陰性空載體對(duì)照及Tmub1沉默慢病毒載體(LV-Tmub1-RNAi)、陰性空載體對(duì)照轉(zhuǎn)染各組細(xì)胞后,與正常生長(zhǎng)的BRL-3A細(xì)胞進(jìn)行比較,通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)各細(xì)胞周期,發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)Tmub1慢病毒載體轉(zhuǎn)染的肝細(xì)胞G2+S期明顯高于沉默Tmub1慢病毒載體轉(zhuǎn)染的肝細(xì)胞G2+S期,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)。結(jié)論:1.肝部分切除術(shù)后Tmub1蛋白與securin蛋白結(jié)合。2.Tmub1在肝切除術(shù)后12小時(shí)開始從胞漿中穿梭進(jìn)入細(xì)胞核,并與securin蛋白相互結(jié)合,48小時(shí)到達(dá)高峰后逐漸下降,而細(xì)胞內(nèi)Tmub1蛋白本身的含量并未發(fā)生明顯改變。3.Tmub1蛋白能夠促進(jìn)肝細(xì)胞增殖。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R657.3
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本文編號(hào)：
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