【摘要】：【目的】本研究旨在應(yīng)用ElectroForce3200力學(xué)試驗(yàn)儀搭載的BioDynamic生物反應(yīng)艙,結(jié)合使用Sylgard184硅橡膠薄膜載體,對體外培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞(Schwann Cells,SCs)施加不同頻率參數(shù)單軸向循環(huán)牽張應(yīng)力(Cyclic Tensile Strain,CTS)。觀察SCs的形態(tài)、分布以及增殖活性的變化并檢測SCs神經(jīng)營養(yǎng)因子和成髓鞘基因的表達(dá)和細(xì)胞骨架肌動蛋白的變化,探究CTS加載于體外培養(yǎng)SCs后的神經(jīng)修復(fù)相關(guān)生物學(xué)行為,選擇適宜的CTS刺激頻率參數(shù),并為CTS結(jié)合SCs應(yīng)用于脊髓損傷臨床治療提供新的方向和理論基礎(chǔ)�！痉椒ā勘狙芯繉Cs進(jìn)行體外分離培養(yǎng)和傳代,將SCs嘗試接種于擁有良好生物相容性和力學(xué)性能的Sylgard184基底膜上進(jìn)行體外培養(yǎng),配合使用ElectroForce3200力學(xué)測試儀,以5%形變量對SCs施以時(shí)長為6小時(shí)的CTS,并依照加載頻率分為對照組(0Hz)、0.25Hz和0.5Hz,共3組。通過相差顯微鏡觀察力學(xué)加載后細(xì)胞形態(tài)、分布情況;使用CCK-8法觀察加載后SCs的增殖情況;通過實(shí)時(shí)定量PCR(Quantitative Real-time-PCR)和免疫印跡法(Western blot)檢測神經(jīng)營養(yǎng)因子和成髓鞘基因在力學(xué)加載后表達(dá)的變化;使用免疫熒光染色(Immunofluorescent staining)檢查力學(xué)加載后細(xì)胞骨架肌動蛋白的變化及其與成髓鞘基因表達(dá)改變的聯(lián)系,獲取實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析�！窘Y(jié)果】本研究成功構(gòu)建體外培養(yǎng)SCs的CTS加載模型,精確地對體外培養(yǎng)的SCs施加不同頻率的CTS刺激。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:對照組(0Hz)SCs形態(tài)及分布無明顯改變,0.25Hz組SCs形態(tài)飽滿,細(xì)胞排列方向呈極性分布(與牽拉方向一致),0.5Hz組的SCs出現(xiàn)局部脫落,散在分布;通過qPCR和Western blot驗(yàn)證和CCK-8檢測增殖情況,結(jié)果表明培養(yǎng)0.25Hz組SCs至第7天時(shí),其增殖活性高于其余兩組(P0.05),且0.25Hz組CTS較其余兩組顯著促進(jìn)SCs神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF、NGF、NT-3)的合成與分泌,并上調(diào)成髓鞘基因Krox-20和MAG的表達(dá)(P0.05);同時(shí),免疫熒光染色法顯示經(jīng)過CTS刺激后Krox-20基因表達(dá)增強(qiáng),并可觀察到F-actin向SCs核周聚集趨勢�！窘Y(jié)論】SCs促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)的相關(guān)生物學(xué)功能受到所加載CTS的影響和調(diào)控。本研究證實(shí)SCs的形態(tài)、分布以及增殖活性均可受到所加載CTS的影響:適宜頻率的CTS刺激可使SCs胞質(zhì)更加充盈,細(xì)胞排列具有方向性(與牽拉方向一致),過高頻率的CTS刺激不利于SCs在基底膜的附著;適宜頻率的CTS作用于SCs可以促進(jìn)細(xì)胞增殖;上調(diào)多種神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF、NGF、NT-3)的合成與分泌并上調(diào)重要成髓鞘基因Krox-20和MAG的表達(dá)。SCs經(jīng)CTS刺激后,成髓鞘基因Krox-20表達(dá)的改變可能是由細(xì)胞骨架F-actin所介導(dǎo),但其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。
【圖文】：

天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文 循環(huán)牽張應(yīng)力對雪旺細(xì)胞形態(tài)和增殖的影響狀排列。將第三代的 SCs 使用免疫化學(xué) S-100 染色鑒定，在光鏡下對細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察：體積相對較小，，外形為長梭形的雙極或多極形態(tài)，胞核較亮，突起較暗，染色呈綠色即 SCs。成纖維細(xì)胞通常呈現(xiàn)不規(guī)則形態(tài)且并未被染色。細(xì)胞S-100 染色后顯示純度良好，為后續(xù)提供了研究基礎(chǔ)（圖 3）。1.2.2 循環(huán)牽張應(yīng)力對雪旺細(xì)胞形態(tài)的影響各頻率刺激下 SCs 形態(tài)在鏡下觀察形態(tài)呈現(xiàn)較明顯差異。對照組（0Hz）：SCs 無特殊改變且無明顯極性分布；0.25Hz 組：SCs 形態(tài)較飽滿，排列方向呈現(xiàn)一定的規(guī)律性分布；0.5Hz 組：部分區(qū)域無 SCs 附著，依然附著的 SCs 分散生長且排列無規(guī)律性（圖 4）。

士學(xué)位論文 循環(huán)牽張應(yīng)力對雪旺細(xì)胞形態(tài)和應(yīng)力對雪旺細(xì)增殖的影響加形變率 5%的 CTS 作用 6 小時(shí)，頻率分為對照組（0完成后 3 天，5 天，7 天應(yīng)用 CCK-8 檢測 SCs 增殖活之后的第 7 天，0.25Hz 組與 0Hz 組，0.25Hz 與 0.5Hz意義（P＜0.05），提示 0.25Hz 組 SCs 在第 7 天的增殖第 3 天和第 5 天各組 OD 值之間則無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異被認(rèn)為是刺激 SCs 增殖的適宜頻率，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R651.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 胡新永;王義生;殷力;陳建文;王振軍;李欣浩;;牽張應(yīng)力對成骨細(xì)胞增殖和誘生型一氧化氮合酶基因表達(dá)的影響[J];中華實(shí)驗(yàn)外科雜志;2016年10期

2 Yong Guo;Qi Lv;Xian-qiong Zou;Zhi-xiong Yan;Yu-xian Yan;;Mechanical Strain Regulates Osteoblast Proliferation Through Ca~(2+)-CaMK-CREB Signal Pathway[J];Chinese Medical Sciences Journal;2016年02期

3 郭巍;李巖;劉q

本文編號：2569255