【摘要】：術(shù)后認(rèn)知功能障礙(POCD)是老年患者術(shù)后常見并發(fā)癥,表現(xiàn)為學(xué)習(xí)、記憶等認(rèn)知功能下降,增加并發(fā)癥和死亡率。目前研究認(rèn)為,POCD的發(fā)病機(jī)制主要為中樞神經(jīng)炎癥、氧化應(yīng)激、膽堿能系統(tǒng)失調(diào)、β淀粉樣蛋白沉積等因素引起的神經(jīng)元凋亡增加、再生減少、突觸可塑性下降等神經(jīng)退行性改變。MicroRNA(miRNA)是一類非編碼小分子RNA,通過與靶基因mRNA的3'非翻譯區(qū)(3'UTR)結(jié)合發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含量豐富,對(duì)神經(jīng)元發(fā)育、分化,突觸聯(lián)系和樹突棘形成等有重要調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn),高齡、應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、缺血再灌注損傷等傷害性刺激可導(dǎo)致miRNA表達(dá)異常,且miRNA通過調(diào)節(jié)神經(jīng)元突觸可塑性參與阿茨海默病(AD)、精神分裂癥、抑郁癥等認(rèn)知障礙性疾病的發(fā)病過程�；谏鲜霭l(fā)現(xiàn),我們推測(cè),術(shù)后學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知損害的發(fā)病機(jī)制之一可能是海馬中miRNA異常表達(dá)導(dǎo)致突觸可塑性下降。故本研究擬通過相關(guān)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)探討老齡小鼠海馬中miRNA的異常表達(dá)與其術(shù)后認(rèn)知功能損害的相關(guān)性。第一部分不同麻醉手術(shù)方式對(duì)老齡小鼠術(shù)后認(rèn)知功能的影響及海馬突觸可塑性情況的觀察目的:探討異氟醚吸入麻醉和腹部手術(shù)對(duì)老齡小鼠術(shù)后認(rèn)知功能的影響,以及術(shù)后海馬神經(jīng)元突觸可塑性變化情況。方法:實(shí)驗(yàn)一:老齡C57BL/6小鼠(18月齡、64只)按體重排序,隨機(jī)分為4組:對(duì)照組(con)、異氟醚組(iso)、手術(shù)組(sur)、異氟醚+手術(shù)組(iso+sur),每組16只,分別施以假手術(shù)、1.8%異氟醚吸入1.5h、局麻腹部手術(shù)、1.8%異氟醚吸入1.5h+局麻腹部手術(shù)處理,并于術(shù)前行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、術(shù)后行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)和條件恐懼實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)各組小鼠學(xué)習(xí)記憶功能。實(shí)驗(yàn)二:老齡C57BL/6小鼠(18月齡、48只)隨機(jī)分為4組,每組12只,分組和處理因素同實(shí)驗(yàn)一,于術(shù)后第3、7天處死各組小鼠取腦組織,行免疫熒光染色觀察海馬組織突觸體素-1(SYN-1)表達(dá)情況,行蛋白印記實(shí)驗(yàn)檢測(cè)突觸后致密95(PSD95)的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果:實(shí)驗(yàn)一:曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中,各組小鼠跨越方格數(shù)和后腳站立次數(shù)相比均無明顯差異(P0.05)。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中,與對(duì)照組相比,手術(shù)組小鼠術(shù)后水迷宮登臺(tái)潛伏期延長(zhǎng)(P0.05),目標(biāo)象限停留時(shí)間縮短(P0.01)、穿臺(tái)次數(shù)減少(P0.05);而與手術(shù)組相比,異氟醚組和異氟醚+手術(shù)組登臺(tái)潛伏期縮短(P0.05),目標(biāo)象限停留時(shí)間增加(P0.05)。條件恐懼實(shí)驗(yàn)中,與對(duì)照組相比,手術(shù)組小鼠術(shù)后第1、3、7天場(chǎng)景測(cè)試凝滯時(shí)間百分比降低(P0.05),術(shù)后第3天聲音測(cè)試凝滯時(shí)間百分比降低(P0.05);與手術(shù)組相比,異氟醚組術(shù)后第3天場(chǎng)景測(cè)試凝滯時(shí)間百分比和聲音測(cè)試凝滯時(shí)間百分比均增加(P0.05),異氟醚+手術(shù)組術(shù)后第3、7天場(chǎng)景測(cè)試凝滯時(shí)間百分比增加(P0.05)。實(shí)驗(yàn)二:免疫熒光染色發(fā)現(xiàn),與其他各組相比,術(shù)后第3天手術(shù)組小鼠海馬組織SYN-1表達(dá)下降,突觸密度減少(P0.05),術(shù)后第7天各組相比無顯著差異(P0.05)。蛋白印記實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,手術(shù)組小鼠海馬組織PSD95術(shù)后第3天表達(dá)量降低(P0.05),與手術(shù)組相比,異氟醚組小鼠海馬PSD95術(shù)后第3天表達(dá)量增加(P0.05);各組小鼠海馬PSD95術(shù)后第7天表達(dá)量無顯著差異(P0.05)。結(jié)論:腹部手術(shù)可致老年小鼠術(shù)后早期空間學(xué)習(xí)記憶能力和關(guān)聯(lián)學(xué)習(xí)記憶能力發(fā)生損害,海馬神經(jīng)元突觸可塑性下降,而異氟醚吸入麻醉可部分逆轉(zhuǎn)腹部手術(shù)造成的認(rèn)知損傷和突觸可塑性下降,具有保護(hù)作用,進(jìn)一步證實(shí)POCD的發(fā)病機(jī)制之一是突觸可塑性下降所致。第二部分術(shù)后認(rèn)知功能障礙老齡小鼠海馬組織microRNA表達(dá)差異分析與初步驗(yàn)證目的:比較和分析術(shù)后認(rèn)知功能障礙老齡小鼠海馬組織microRNA表達(dá)變化情況,并初步探索其影響認(rèn)知功能的可能機(jī)制。方法:實(shí)驗(yàn)一:老齡C57BL/6小鼠(18月齡、28只)按體重排序,隨機(jī)分為2組:對(duì)照組(con)和手術(shù)組(sur),每組14只,分別施以假手術(shù)和局麻腹部手術(shù)。術(shù)后24h每組隨機(jī)抽取3只小鼠處死取海馬組織,抽提總RNA,行miRNA microarray基因芯片檢測(cè)兩組小鼠海馬miRNA表達(dá)情況;每組隨機(jī)抽取3只小鼠處死,抽提海馬總RNA,液氮保存以備qRT-PCR驗(yàn)證實(shí)驗(yàn);每組剩余8只小鼠行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)認(rèn)知功能。實(shí)驗(yàn)二:對(duì)實(shí)驗(yàn)一 miRNA microarray基因芯片中篩選出的miRNA(表達(dá)變化1.5倍以上)利用miRanda,miRDB,miRWalk等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè),并行GO分析及KEGG通路預(yù)測(cè);對(duì)基因芯片篩選出的miRNA隨機(jī)抽取若干(miR-16-3p, miR-290a-5p, miR-217-5p,miR-382-3p, miR-466b-3p, miR-183-5p)行qRT-PCR驗(yàn)證芯片結(jié)果。實(shí)驗(yàn)三:老齡C57BL/6小鼠(18月齡、36只)按體重排序,隨機(jī)分為4組:對(duì)照組(con)、異氟醚組(iso)、手術(shù)組(sur)、異氟醚+手術(shù)組(iso+sur),每組9只,分別施以假手術(shù)、1.8%異氟醚吸入1.5h、局麻腹部手術(shù)、1.8%異氟醚吸入1.5h+局麻腹部手術(shù)處理,于術(shù)后第1、3、7天每組隨機(jī)處死3只小鼠取海馬組織,對(duì)與認(rèn)知功能相關(guān)的 miRNA(miR-155-5p,miR-582-5p, miR-134-5p)行 qRT-PCR檢測(cè),對(duì)上述miRNA預(yù)測(cè)的靶蛋白環(huán)腺苷酸應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(CREB),腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)行Western Blot檢測(cè)。結(jié)果:實(shí)驗(yàn)一: miRNA microarray基因芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,腹部手術(shù)后24h,手術(shù)組小鼠海馬組織miRNA表達(dá)上調(diào)1.5倍以上的有29個(gè),表達(dá)下調(diào)1.5倍以上的有34個(gè)。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),腹部手術(shù)造成老齡小鼠術(shù)后登臺(tái)潛伏期延長(zhǎng)(P0.05),目標(biāo)象限停留時(shí)間縮短(P0.01)、穿臺(tái)次數(shù)減少(P0.05),空間學(xué)習(xí)記憶能力下降。實(shí)驗(yàn)二:通過對(duì)實(shí)驗(yàn)一中篩選的表達(dá)改變1.5倍以上的miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),有36個(gè)miRNA與creb1(CREB基因)的表達(dá)有關(guān),有23個(gè)miRNA與bdnf(BDNF基因)的表達(dá)有關(guān)。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)顯示,隨機(jī)抽取的miR-16-3p,miR-290a-5p, miR-217-5p,miR-382-3p, miR-466b-3p,miR-183-5p 的表達(dá)情況與基因芯片檢測(cè)的結(jié)果相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)篩選的miRNA行GO分析發(fā)現(xiàn),涉及生物學(xué)途徑(BP)的GO Term有447個(gè),涉及分子功能(MF)的GO Term有74個(gè),細(xì)胞定位(CC)的有36個(gè),多與炎癥、神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育分化、突觸形態(tài)和功能有關(guān);行KEGG通路預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)有多條與認(rèn)知功能有關(guān)的信號(hào)通路被激活,如神經(jīng)營養(yǎng)因子信號(hào)通路(Neurotrophin signaling pathway)、環(huán)腺苷酸信號(hào)通路(cAMP signaling pathway)、長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(Long-term potentiation)、絲裂原活化蛋白激酶通路(MAPK signaling pathway)等。實(shí)驗(yàn)三:選取與CREB和BDNF表達(dá)調(diào)控均有關(guān)的3個(gè)miRNA,即 miR-155-5p, miR-582-5p,miR-134-5p 行 qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與其他各組相比,術(shù)后第1天,該3個(gè)miRNA在手術(shù)組小鼠海馬中表達(dá)明顯增高(P0.05),術(shù)后第3天miR-155-5p表達(dá)依然增高(P0.05),其余miRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,術(shù)后第7天各組小鼠海馬組織miRNA表達(dá)基本無差別。WestemBlot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與其他各組相比,術(shù)后第1、3天,手術(shù)組小鼠海馬組織CREB活性降低,第7天各組CREB活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;術(shù)后第3、7天,與其他各組相比,手術(shù)組小鼠海馬組織BDNF表達(dá)量減少。結(jié)論:腹部手術(shù)可致老齡小鼠術(shù)后認(rèn)知功能發(fā)生損害,與術(shù)后早期海馬中miRNA表達(dá)譜改變有關(guān)。手術(shù)引起的創(chuàng)傷、中樞炎癥、氧化應(yīng)激、缺血再灌注損傷等,使機(jī)體通過上調(diào)或下調(diào)miRNA的表達(dá),對(duì)神經(jīng)元的生長(zhǎng)和凋亡、突觸的形態(tài)和功能、膠質(zhì)細(xì)胞活化等多條信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)控,影響突觸可塑性,進(jìn)而影響認(rèn)知功能。其中,microRNA-CREB-BDNF通路可能是POCD發(fā)病機(jī)制之一。
【圖文】：

院動(dòng)物倫理委員會(huì)許可。逡逑實(shí)驗(yàn)用小鼠的排除標(biāo)準(zhǔn)是：１．小鼠頭、軀干、四肢形態(tài)異常者；２．活動(dòng)明顯不協(xié)逡逑調(diào)者；３．毛發(fā)色澤欠佳或脫毛者。見圖１－１。逡逑擙逡逑圖１－１成年與老年Ｃ５７／ＢＬ６小鼠逡逑１７逡逑

逡逑圖１－２實(shí)驗(yàn)一示意圖小鼠分４組（ｎ＝１６），，術(shù)前行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)（ＯＦｌ＞術(shù)后行Ｍｏｒｒｉｓ水迷宮實(shí)驗(yàn)逡逑（ＭＷＭ）和條件恐懼實(shí)驗(yàn)（ＦＣＴ）邋ｃｏｎ：對(duì)照組；ｉｓｏ：異氟釀組；ｓｕｒ：手術(shù)組；ｉｓｏ＋ｓｕｒ：異氟酸＋手術(shù)組；逡逑ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ：行異氟越吸入處理；ｓｕｒｇｅｒｙ：行腹部手術(shù)處理逡逑實(shí)驗(yàn)二：老齡Ｃ５７ＢＬ／６小鼠（１８月齡、４８只）按體重編號(hào)，ＣＨＩＳＳ軟件隨機(jī)分為逡逑４組，每組１２只，分組和處理因素同實(shí)驗(yàn)一。實(shí)驗(yàn)流程如下（見圖１－３），行處理（ｄａｙＯ）逡逑后，于術(shù)后第３、７天隨機(jī)處死各組小鼠取腦組織，行免疫熒光染色觀察海馬組織突逡逑觸體素－ｌ（ＳＹＮ－ｌ）表達(dá)情況，行蛋白印記實(shí)驗(yàn)檢測(cè)突觸后致密９５（ＰＳＤ９５）的相對(duì)表達(dá)逡逑量。逡逑邐邋ｊｎｏｎｅ逡逑ｃｏｎ（ｎ邋＝邋１２）邐１邋Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ邋Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ逡逑邐邋ｄａｙ0邐（ｎ邋＝邋３）邐；邋邐（ｎ邋＝邋３）邐、逡逑邐邋ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ邐ｄａｙ３邐ｄａｙ７逡逑丨丨邋ｓ0＿）邐｜邐＾￣Ｑ＞邋—逡逑邐邋ｓｕｑｅｒｖ逡逑ｓｕｒ（ｎ邋＝邋１２）邐邐＾邐Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ邐Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ逡逑邐Ｊ邐Ｌ邐邐ｄａｙＯ邐（ｎ邋＝邋３）邐）邐（ｎ邋＝邋３）逡逑ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ邐ｄａｙ邋３邐ｄａｙ邋７逡逑｜邋＿ｉｓｏ邋＋邋ｓｕｒ（ｎ邋＝邋１２ｊ＿Ｊ邐￣＾逡逑圖１－３實(shí)驗(yàn)二示意圖小鼠分４組（ｎ＝１２）
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R614

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Yun-zhi LING;Wei MA;Li YU;Ye ZHANG;Qi-sheng LIANG;;七氟烷麻醉誘導(dǎo)的認(rèn)知功能損傷與內(nèi)測(cè)前額葉皮層中PSD95表達(dá)量降低有關(guān)（英文）[J];Journal of Zhejiang University-Science B(Biomedicine & Biotechnology);2015年09期

本文編號(hào)：2560614