【摘要】：研究背景和目的:腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)蛋白-8樣分子2(tumor necrosis factor-αinduced protein 8 like-2, TIPE2)在機(jī)體免疫細(xì)胞內(nèi)存在表達(dá),可能參與燒傷后膿毒癥的病理生理過(guò)程。但TIPE2表達(dá)是否影響樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells, DC)的免疫功能迄今尚不清楚。實(shí)驗(yàn)方法:1.采用免疫磁珠法分離正常BALB/c小鼠脾臟DC。采用激光共聚焦技術(shù)精確定位DC細(xì)胞內(nèi)TIPE2的表達(dá);應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和Western blot檢測(cè)TIPE2在DC細(xì)胞中的基因和蛋白表達(dá)水平。體外實(shí)驗(yàn)部分將攜帶TIPE2 siRNA/TIPE2 RNA的慢病毒載體轉(zhuǎn)染至DC細(xì)胞,抑制/上調(diào)DC細(xì)胞內(nèi)TIPE2基因/蛋白的表達(dá);體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分通過(guò)尾靜脈注射攜帶TIPE2 siRNA/TIPE2 RNA的慢病毒載體,飼養(yǎng)兩周待表達(dá)穩(wěn)定后,復(fù)制小鼠重度燙傷模型。DC細(xì)胞表面抗原、共刺激分子和抗原呈遞分子采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè);DC對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響應(yīng)用CCK-8法檢測(cè);DC自身分泌的細(xì)胞因子、DC/T共培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子水平的變化及T淋巴細(xì)胞核內(nèi)活化T細(xì)胞的核因子(nuclear factor of activated T cells,NF-AT)活性采用ELISA檢測(cè)。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:計(jì)量資料用x±s表示,采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析各組數(shù)據(jù),倆樣本間比較采用t檢驗(yàn),單因素多組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析(One-WayANOVA)。以P0.05代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。主要結(jié)果和結(jié)論:1.激光共聚焦顯微鏡成像分析顯示TIPE2在DC胞漿中表達(dá),TIPE2在DC內(nèi)存在基因和蛋白表達(dá)。2.流式結(jié)果顯示,CD80、CD86及主要組織相容性復(fù)合體-Ⅱ類分子(MHC-Ⅱ)表達(dá)在TIPE2沉默DC細(xì)胞組顯著增強(qiáng),TIPE2過(guò)表達(dá)組3種表面分子的表達(dá)均明顯降低。小鼠燙傷24h后,siRNA-TIPE2轉(zhuǎn)染組DC表面3種分子表達(dá)均較燙傷組出現(xiàn)顯著上調(diào),TIPE2 RNA轉(zhuǎn)染組其表達(dá)則明顯下調(diào)(P，0.01)。3. ELISA結(jié)果顯示,siRNA-TIPE2轉(zhuǎn)染組DC細(xì)胞上清液中檢測(cè)到較高水平IL-12、TNF-α(P0.01)。小鼠嚴(yán)重燙傷后,siRNA-TIPE2轉(zhuǎn)染組IL-12、TNF-α生成量顯著升高,而TIPE2RNA轉(zhuǎn)染組兩種細(xì)胞因子水平明顯降低(P0.01)。4. CCK8法檢測(cè)顯示,沉默TIPE2表達(dá)后T細(xì)胞增殖活性較正常組增強(qiáng)。小鼠燙傷24h后,siRNA-TIPE2轉(zhuǎn)染組T細(xì)胞增殖活性明顯增強(qiáng),TIPE2上調(diào)組T細(xì)胞增殖活性則顯著減弱(P0.01)。5. TIPE2-RNA轉(zhuǎn)染DC細(xì)胞后,IL-2水平及T細(xì)胞NF-AT活性顯著降低。燙傷24 h后TIPE2 RNA轉(zhuǎn)染組IL-2水平及T細(xì)胞NF-AT活性較燙傷組明顯降低,TIPE2 siRNA轉(zhuǎn)染組IL-2生成量及T細(xì)胞NF-AT活性顯著升高(P0.01)。6. TIPE2 siRNA轉(zhuǎn)染DC細(xì)胞后,IFN-γ生成量增加,IL-4生成量下降,T細(xì)胞向輔助性T細(xì)胞(Th) 1方向極化。與燙傷組相比,TIPE2 RNA轉(zhuǎn)染組IFN-γ水平降低而IL-4含量升高,TIPE2siRNA轉(zhuǎn)染組,IFN-y水平上升而IL-4含量顯著降低(P0.01)。上述結(jié)果提示,TIPE2可顯著影響嚴(yán)重燙傷小鼠DC細(xì)胞的分化成熟及其介導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞功能。
【圖文】：

２．３邋ＤＣ細(xì)胞Ｔ１ＰＥ２邋ｍＲＮＡ／蛋白表達(dá)逡逑收集分離純化ＤＣ細(xì)胞，ＲＴ－ＰＣＲ檢測(cè)到１４７邋ｂｐ大小的特異性ＴＩＰＥ２目的基因條逡逑帶（圖２），Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ證實(shí)ＤＣ細(xì)胞中存在分子量為２１邋ｋＤ的清晰ＴＩＰＥ２條帶（圖２）。逡逑ＣＤ４＋Ｔ淋巴細(xì)胞、調(diào)節(jié)性Ｔ細(xì)胞和巨噬細(xì)胞內(nèi)ＴＩＰＥ２作為陽(yáng)性對(duì)照，ｐ－ａｃｔｉｎ作為內(nèi)逡逑參照。逡逑１３逡逑

正常ＤＣ對(duì)照組、ＴＩＰＥ２ｓｉＲＮＡ轉(zhuǎn)染ＤＣ細(xì)胞組、ＴＩＰＥ２ＲＮＡ轉(zhuǎn)染ＤＣ細(xì)胞組２４ｈ逡逑后，流式細(xì)胞結(jié)果經(jīng)過(guò)方差分析顯示，ＣＤ８０、ＣＤ８６及ＭＨＣ－ＩＩ平均熒光強(qiáng)度在ＴＩＰＥ２逡逑沉默ＤＣ細(xì)胞組顯著升高（表２－２和圖２－２，，邋Ｐ＝０．０００），ＴＩＰＥ２過(guò)表達(dá)ＤＣ組３種共刺激分逡逑子的平均熒光強(qiáng)度明顯降低（表２－２和圖２－２，Ｐ＝０．０００）。如上所述，沉默ＤＣ細(xì)胞ＴＩＰＥ２逡逑表達(dá)后ＣＤ８０、ＣＤ８６及ＭＨＣ－ＩＩ熒光強(qiáng)度均顯著增強(qiáng)，說(shuō)明ＤＣ細(xì)胞內(nèi)ＴＩＰＥ２表達(dá)顯逡逑著影響ＤＣ細(xì)胞的成熟分化狀態(tài)。此外，小鼠脾臟ＤＣ內(nèi)ＴＩＰＥ２蛋白抑制或過(guò)表達(dá)效逡逑果滿意（表２－１和圖２－１，邋Ｐ＝０．０００）。逡逑表２－１邋ＤＣ細(xì)胞中ＴＩＰＥ２蛋白沉默／過(guò)表達(dá)效果（三士ｓ）逡逑Ｔａｂｌｅ邋２－１邋Ｒｅｌａｔｉｖｅ邋ａｂｕｎｄａｎｃｅ邋ｏｆ邋ＴＩＰＥ２邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｌｅｖｅｌｓ邋ｉｎ邋ＤＣｓ邋（邋ｘ±ｓ）逡逑２０逡逑
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R644

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