【摘要】：目的:復蘇低溫凍存的人退變髓核細胞,并觀察其活力;體外篩選最佳Fas-si RNA并構建其慢病毒載體;Sox9、Fas及Sox9聯(lián)合Fas體外轉(zhuǎn)染人退變髓核細胞,并研究它們在體外對人退變髓核細胞的影響。方法:復蘇液氮儲存的人退變椎間盤髓核細胞,對細胞進行培養(yǎng),并觀察其活力情況。設計Fas-si RNA-慢病毒載體,經(jīng)酶切和基因測序鑒定重組克隆,對Fas-si RNA進行慢病毒包裝,并檢測其滴度。將Sox9過表達和Fas干擾以慢病毒為載體在體外聯(lián)合轉(zhuǎn)染人退變髓核細胞進行實驗研究,為了便于熒光顯微鏡觀察病毒轉(zhuǎn)染效率,用紅色熒光標記Sox9基因,藍色熒光標記Fas基因。實驗分為(1)空白對照組;(2)陰性對照組;(3)Sox9過表達組;(4)Fas干擾組;(5)Sox9過表達+Fas干擾組。攜帶目的基因的慢病毒轉(zhuǎn)染人退變髓核細胞72h后,通過熒光顯微鏡觀察,而檢測病毒轉(zhuǎn)染效率;CCK8檢測各組細胞增殖情況;RT-PCR檢測各組Sox9、Fas、Ⅱ型膠原、蛋白多糖在m RNA水平的表達情況;Western-Blot分別檢測各組Ⅱ型膠原、蛋白多糖在蛋白質(zhì)水平的表達。結果:人退變髓核細胞成功復蘇培養(yǎng)后,細胞生長正常、狀態(tài)良好。經(jīng)酶切及重組克隆基因測序鑒定顯示,應用基因重組技術成功構建Fas-si RNA慢病毒載體,檢測滴度大于1x108TU/ml。熒光顯微鏡觀察72h后(3)、(4)、(5)組的載體轉(zhuǎn)染人退變髓核細胞其轉(zhuǎn)染效率均達到80%以上。CCK8檢測結果顯示與(1)組相比(2)組細胞增殖變化不大,比較差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);(3)組、(4)組、(5)組與(1)組相比細胞增殖率均有明顯增高,其中(5)組的細胞增殖率增高最為顯著,比較差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。運用RT-PCR檢測方法證實在Sox9、Fas、Ⅱ型膠原和蛋白多糖m RNA表達水平上(1)組與(2)組相比變化不大,比較差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);(3)組中Sox9的m RNA表達升高明顯,(4)組中Fas的m RNA表達水平降低明顯,(5)組中Sox9的m RNA表達水平升高最為顯著、Fas的m RNA表達水平降低最為顯著,與(1)組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。Western-blot檢測結果表明與(1)組相比(2)組Ⅱ型膠原和蛋白多糖表達變化不明顯,比較差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);(3)組、(4)組Ⅱ型膠原和蛋白多糖表達均有明顯升高,(5)組升高最為顯著,與(1)組比較差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論:慢病毒介導的Fas-si RNA可以顯著抑制人退變髓核細胞中Fas基因的表達;上調(diào)Sox9基因的表達及沉默F(xiàn)as基因的表達能夠增加人退變髓核細胞外基質(zhì)Ⅱ型膠原和蛋白多糖的表達量,實驗結果顯示Sox9和Fas基因與椎間盤退變有相關性,通過此生物學效應有望阻止或逆轉(zhuǎn)椎間盤退變。
【圖文】：

結果結果復蘇后形態(tài)觀察退變髓核細胞復蘇后，，顯微鏡下觀察細胞呈圓形狀（如圖 1），培養(yǎng)箱培養(yǎng) 1 周，顯微鏡下觀察人退變髓核細胞貼壁生長呈長梭常，狀態(tài)良好（如圖 2）。

狀態(tài)良好（如圖 2）。圖 1 人退變髓核細胞復蘇未貼壁時形態(tài)圖2 人退變髓核細胞貼壁后形態(tài)2 實時熒光定量 PCR 檢測 Fas 干擾效果可以看出三條 Fas-siRNA 干擾效果都比較明顯（如圖 3)，而 Fas-siRNA-1053 干擾效果最佳，選擇 Fas-siRNA-1053 進行慢病毒包裝。
【學位授予單位】：青島大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R681.53

【參考文獻】

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本文編號：2558222