發(fā)布時(shí)間：2019-11-01 22:49

【摘要】：背景:椎間盤退行性疾病(disc degenerative disease,DDD)是一類以椎間盤(intervertebral disc,IVD)髓核(nucleus pulposus,NP)退變?yōu)楹诵牟±碜兓⒁訬P碎裂、IVD突出為主要病理結(jié)果,進(jìn)而引起一系列臨床癥狀的脊柱疾患,其人群發(fā)病率極高,嚴(yán)重影響中老年人的勞動(dòng)能力和生活質(zhì)量,已成為日益突出的社會(huì)健康問(wèn)題。目前,針對(duì)DDD的治療均以緩解和改善臨床癥狀為目的,尚無(wú)修復(fù)退變碎裂的NP、重建IVD的生物力學(xué)功能的臨床治療手段。組織工程技術(shù)的發(fā)展為NP的再生修復(fù)展現(xiàn)出嶄新的前景,日益受到廣泛關(guān)注。目的:IVD在體內(nèi)主要是發(fā)揮生物力學(xué)功能,承載著較高的應(yīng)力負(fù)荷,其中NP更是承載了脊柱所受到的70%軸向應(yīng)力負(fù)荷。因此組織工程髓核(tissue-engineered nucleus pulposus,TE-NP)在植入體內(nèi)時(shí)應(yīng)具有良好的力學(xué)性能和生物學(xué)功能,保證在較高的應(yīng)力負(fù)荷下TE-NP可以維持其結(jié)構(gòu)和功能,為NP組織提供再生模板,恢復(fù)IVD的生物力學(xué)功能,重建脊柱的生物力學(xué)。然而,目前TE-NP的生物力學(xué)性能的不足是限制TE-NP進(jìn)一步發(fā)展的重要瓶頸問(wèn)題之一。本研究旨在構(gòu)建一種具有較強(qiáng)力學(xué)性能和生物活性的TE-NP,然后在此基礎(chǔ)之上,研究不同強(qiáng)度軸向壓應(yīng)力對(duì)TE-NP內(nèi)髓核細(xì)胞(NPCs)生物學(xué)功能的影響。方法:本課題在前期研究的基礎(chǔ)之上,制備了一種由天然材料——氧化葡聚糖(oxidative dextran,ODex)、氨基化明膠(amino gelatin,MGel)以及合成材料——四臂聚乙二醇-丙烯酸酯(4-arm-poly-(ethylene glycol)-acrylate,4A-PEG-Acr)構(gòu)成的、適用于NP修復(fù)的強(qiáng)化力學(xué)性能多層互穿多聚物網(wǎng)絡(luò)(interpenetrating polymer network,IPN)水凝膠。本研究通過(guò)調(diào)整IPN水凝膠中4A-PEG-Acr的比例,檢測(cè)孔徑、孔隙率、力學(xué)性能、水合能力以及細(xì)胞相容性等理化性能,以優(yōu)化篩選適用于TE-NP的性能最優(yōu)的、仿生的IPN水凝膠,然后觀察該IPN水凝膠內(nèi)三維(three dimensional,3D)培養(yǎng)的NPCs增殖活性、生化成分含量、NP特異性基因和胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)相關(guān)蛋白的表達(dá)。在此基礎(chǔ)之上,將TE-NP置入前期自主研發(fā)的 智能化反饋調(diào)控組織軸向應(yīng)力仿生施加及培養(yǎng)系統(tǒng)‖中,運(yùn)用不同強(qiáng)度的動(dòng)態(tài)軸向壓應(yīng)力加載于TE-NP以增強(qiáng)其生物學(xué)功能,觀察不同強(qiáng)度的壓應(yīng)力對(duì)TE-NP的細(xì)胞增殖活性、ECM合成、細(xì)胞表型、合成代謝、分解代謝、炎癥相關(guān)基因表達(dá)、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞骨架的影響,探索軸向壓應(yīng)力對(duì)TE-NP生物學(xué)功能的效應(yīng) 窗‖,尋找對(duì)TE-NP生物學(xué)功能發(fā)揮正向調(diào)控作用的軸向壓應(yīng)力的適宜強(qiáng)度。結(jié)果:(1)由4A-PEG-acr、ODex和MGel通過(guò)兩步交聯(lián)反應(yīng)制成的IPN水凝膠是適用于NP組織工程的良好支架材料。當(dāng)三者的成分比例為2:3:5時(shí),該水凝膠具有仿生的3D結(jié)構(gòu)、高孔徑、高強(qiáng)度、高韌性、與NP類似的吸水膨脹能力以及良好的細(xì)胞相容性。接種于該水凝膠中的NPCs具有良好的增殖活力,并維持了天然的表型,具有良好的生物合成能力。(2)不同強(qiáng)度的軸向壓應(yīng)力對(duì)TE-NP的生物學(xué)功能產(chǎn)生了不同的影響。根據(jù)本研究發(fā)現(xiàn),低強(qiáng)度的壓應(yīng)力(1%~10%)尤其是壓縮量為1%的壓應(yīng)力可以有效地增強(qiáng)TE-NP的細(xì)胞增殖活性和合成代謝能力,減少了NPCs的分解代謝、炎癥相關(guān)基因表達(dá)和凋亡,并維持細(xì)胞正常的類圓形結(jié)構(gòu);而高強(qiáng)度的壓應(yīng)力(15%-20%)對(duì)TE-NP的生物學(xué)功能起到了負(fù)性調(diào)節(jié)作用,導(dǎo)致了NPCs的分解代謝、炎癥相關(guān)基因和凋亡相關(guān)基因表達(dá)的上調(diào),合成代謝減少,波形蛋白的表達(dá)升高且細(xì)胞形態(tài)呈長(zhǎng)梭形改變。全文結(jié)論:由4A-PEG-acr、ODex和MGel通過(guò)兩步交聯(lián)反應(yīng)制成的IPN水凝膠是適用于NP組織工程的良好支架材料,當(dāng)三者的成分比例為2:3:5時(shí)該水凝膠具有強(qiáng)化的力學(xué)性能和良好的細(xì)胞相容性,有利于承載一定強(qiáng)度的應(yīng)力負(fù)荷。以該水凝膠為支架構(gòu)建的TE-NP在低強(qiáng)度的應(yīng)力作用(1-10%)尤其是壓縮量為1%的低強(qiáng)度壓應(yīng)力作用下,細(xì)胞維持了天然的類圓形結(jié)構(gòu),內(nèi)部細(xì)胞增殖活性和合成代謝能力明顯增強(qiáng),進(jìn)一步增強(qiáng)了TE-NP的生物活性;然而,高強(qiáng)度的壓應(yīng)力作用(15%-20%)對(duì)TE-NP的生物學(xué)功能起到了負(fù)性調(diào)節(jié)的作用。本研究制備具有良好的力學(xué)性能和生物活性的TE-NP,并發(fā)現(xiàn)低強(qiáng)度壓應(yīng)力可以增強(qiáng)TE-NP的生物學(xué)功能,為其臨床應(yīng)用奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和提供了理論依據(jù)。
【圖文】：

取 5 g 的四臂 PEG 置入除去水的二氯甲烷中，蒸餾，待冷卻后，向反應(yīng)體系中加入 1115 ul 的三乙胺并充分?jǐn)嚢杌靹颉ｋS后，向反應(yīng)體系中充入氮?dú)猓ＷC體系處于無(wú)O2的狀態(tài)，將 325 ul 丙烯酸酯加入溶液中，避光反應(yīng)，用恒溫磁力攪拌器在 37℃下攪拌反應(yīng) 24 h。反應(yīng)結(jié)束后，抽濾二氯甲烷，加入無(wú)水乙醚沉淀三次后，將白色固體產(chǎn)物溶于雙蒸水。將溶液轉(zhuǎn)移至預(yù)處理過(guò)的透析袋（MWCO1000）中，放入大體積的雙蒸水中進(jìn)行透析，每天換水 4 次，共透析 4 天。將透析產(chǎn)物在超低溫冰箱中預(yù)凍后置于冷凍干燥機(jī)中凍干。稱重，置于真空干燥器保存。2.2.4.5 IPN 水凝膠的合成使用兩步反應(yīng)法合成 IPN 水凝膠。將 ODex、MGel、4A-PEG-Acr 按照 20 wt %的濃度溶于 PBS，用磁力攪拌器將其充分混勻。將 I2959 按照 1%的濃度溶于 DMSO 中，震蕩混勻。將上述四種溶液同時(shí)灌注在直徑為 10 mm 的圓柱形模具中，在 37℃下反應(yīng) 15 min，然后用 5 mWcm-2 的紫外光（365nm）照射 5 分鐘，遂成膠。IPN 水凝膠合成的步驟如圖 2-1 所示。

第三軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文充分吹打均勻，隨后將水凝膠-細(xì)胞懸液加入圓柱形模具（直徑=10 mm，，在37℃下反應(yīng)15 min，然后用5 mWcm-2的紫外光（365nm）照射5分鐘了TE-NP。將TE-NP置于本課題組前期自主研發(fā)的 智能化反饋調(diào)控組織軸施加及培養(yǎng)系統(tǒng)‖（如圖2-2所示）中進(jìn)行長(zhǎng)期培養(yǎng)液循環(huán)灌流培養(yǎng)，，每天
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R681.53

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本文編號(hào)：2554178