【摘要】：背景:瘢痕是人體創(chuàng)面修復過程的一種自然產(chǎn)物,其中病理性瘢痕則是皮膚損傷后創(chuàng)面過度修復引起以大量ECM合成及沉積為特征的皮膚纖維化疾病。它主要包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩,其中增生性瘢痕(hypertrophic scar,HS)在臨床中非常多見,其表現(xiàn)為突出皮膚表面或呈持續(xù)生長的亢奮狀態(tài)。大量研究表明,TGF-β是促進創(chuàng)面修復及瘢痕形成的關鍵效應因子,TGF-β的生物活性的發(fā)揮主要通過Smads家族介導的。而TGF-β/Smad信號通路主要通過活化的TGF-β與其胞膜TβRII(TGFβ-receptor II)相結(jié)合,促使TβRI(TGFβ-receptor I)與TβRII形成受體異聚體,隨后TβRI的GS區(qū)磷酸化,激活TβRI,與Smad2和Smad3形成TβRI-SARA-Smads復合體,隨后將Smad2和Smad3磷酸化,與Smad4形成異源復合物轉(zhuǎn)入細胞核,最終調(diào)控成纖維細胞的增值、分化及膠原代謝,促進增生性瘢痕形成。由此可見TβRI是TGF-β/Smad信號通路的關鍵組分。不僅如此,抑制型蛋白Smad7是TGF-β/Smad信號通路的主要負性調(diào)節(jié)因子,Smad7通過負反饋調(diào)節(jié)著正性與負性Smads之間的平衡。近年來研究表明,泛素特異性蛋白酶4(USP4)可增強TGF-β信號通路的水平,但在HS形成中,USP4對TGF-β信號通路的作用還未見報道。本實驗就從組織水平及細胞水平研究USP4對瘢痕形成的調(diào)控作用,為瘢痕的防治探索新方法。目的:探討USP4在HS形成中的重要作用,尤其是TGF-β/Smad信號通路的調(diào)控作用;通過泛素特異性蛋白酶抑制劑(Vialinin A)抑制USP4表達,明確USP4與TβRI、Smad7的相關性,闡明USP4對增生性瘢痕的作用機制,為臨床上利用USP4作為藥物作用靶點治療HS提供重要的理論依據(jù)。方法:1、取本院整形外科臨床上增生性瘢痕患者的HS標本以及瘢痕周圍正常皮膚組織標本15例(傷后6個月~1年內(nèi)),低溫下迅速帶回實驗室處理;部分組織生理鹽水洗凈后用4%中性甲醛固定后,常規(guī)脫水和石蠟包埋,進行免疫組化檢測;部分組織用于Western blot檢測人增生性瘢痕組織中USP4及TβRI蛋白表達水平差異,并以正常皮膚組織(Normal tissue,NS)作為對照。2、收集人增生性瘢痕組織及瘢痕周圍正常皮膚標本,采用改良組織塊聯(lián)合胰酶消化法體外培養(yǎng)人增生性瘢痕成纖維細胞(Hypertrophic scar fibroblast,HSFB)和正常皮膚成纖維細胞(Normal skin fibroblast,NSFB)。①取第4代FB(Fibroblast),Western blot檢測HSFB與NSFB中USP4、TβRI和Smad7蛋白表達水平;②人增生性瘢痕成纖維細胞鋪板培養(yǎng)24h后加入5μmol/LVialinin A(USP4抑制劑),在0h、12h、24 h、48h后收取細胞,運用Western blot再次檢測USP4、TβRI及Smad7蛋白的表達水平;③人增生性瘢痕成纖維細胞以每孔1×104/ml密度接種于96孔板培養(yǎng)24h后加入5μmol/L Vialinin A,MTT法檢測Vialinin A對HSFB增殖的影響,并以未干預的細胞作為對照。結(jié)果:1、免疫組化結(jié)果顯示:USP4在NS中表皮基底細胞中有少量陽性表達,FB中未見明顯陽性表達,在HS中除了表皮基底細胞外,FB胞膜及胞漿中存在大量的陽性表達,兩者比較具有差異(P0.01);TβRI在NS中FB中基本不著色,在HS中FB胞膜及胞漿可見大量陽性表達,兩者比較具有顯著差異(P0.01)。2、Western Blot結(jié)果顯示:USP4及TβRI在HS高表達,USP4及TβRI在NS表達水平較低,兩者比較均具有統(tǒng)計學差異性(P0.05);USP4及TβRI在HSFB中的蛋白表達較NSFB的高((P0.05),而Smad7蛋白在HSFB中低表達(P0.05);加入Vialinin A后,隨著時間推移,USP4及TβRI蛋白在HSFB中的表達水平逐漸降低,在作用12h后明顯降低(P0.05),Smad7蛋白的表達則逐漸升高(P0.05),進一步證實USP4與TβRI正相關,與Smad7負相關。3、MTT結(jié)果顯示:加入Vialinin A后的HSFB與未被干預的HSFB相比,增殖活性降低(P0.05)。結(jié)論:1、增生性瘢痕組織及細胞中USP4及TβRI蛋白明顯增高,Smad7在增生性瘢痕成纖維細胞低表達。2、下調(diào)人增生性瘢痕成纖維細胞中USP4表達能夠顯著降低TβRI的表達,上調(diào)Smad7的表達,提示USP4可能通過調(diào)控TGF-β/Smad信號通路影響瘢痕組織形成。3、下調(diào)人增生性瘢痕成纖維細胞中USP4表達能夠使增生性瘢痕成纖維細胞增殖減慢,有望為瘢痕的防治提供新思路。
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【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R622

【參考文獻】

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1 李衍常;高媛;徐忠偉;蘭秋艷;徐平;;蛋白質(zhì)組學在去泛素化酶研究中的應用[J];生物工程學報;2014年09期

2 劉愛東;王s，

本文編號：2264074