本文選題：人骨髓間充質干細胞　切入點：梯度密度離心　出處：《廣西醫(yī)科大學》2015年博士論文

【摘要】：第一部分人骨髓間充質干細胞體外培養(yǎng)與鑒定[目的]運用實驗室已經(jīng)成功創(chuàng)建的人骨髓間充質干細胞培養(yǎng)方案,分離、培養(yǎng)和鑒定hMSCs,為后續(xù)研究提供充足的干細胞來源。[方法]采用密度梯度離心法分離出單個核細胞,細胞貼壁法在α-MEM培養(yǎng)基中獲得原代hMSCs,隨后進行傳代培養(yǎng)。對成骨細胞分化采用堿性磷酸酶活性檢測和Alizarin Red S染色進行鑒定；對脂肪細胞分化應用Oil Red-O染色方法進行鑒定；應用Alcian blue染色對軟骨細胞分化進行鑒定。[結果]骨髓細胞培養(yǎng)6-24小時,胞體形狀由圓形逐步變?yōu)槿切突虿灰?guī)則形狀。培養(yǎng)第2-4天間充質細胞形態(tài)發(fā)生改變,細胞形態(tài)逐漸變?yōu)槌衫w維細胞樣的梭型,并聚集成集落；培養(yǎng)7-14天,細胞長滿培養(yǎng)瓶底面積的70%-80%,細胞排列更加緊密,此時的骨髓間充質干細胞為單層細胞。對細胞進行成脂誘導分化,可檢測不同形狀的Oil Red-O陽性染色細胞形成；成骨細胞誘導分化后,堿性磷酸酶活性檢測,以及Alizarin Red S染色的陽性細胞形成；誘導成軟骨細胞分化后可見Alcian blue染色陽性細胞形成。[結論]本試驗采用的方法可以成功分離、培養(yǎng)及擴增人骨髓間充質干細胞,并鑒定其具有成骨、成脂、成軟骨分化能力。第二部分DHEA上調IGF-I基因表達并促進hMSCs向成骨分化[目的]本研究驗證DHEA是否通過調節(jié)IGF-I從而促進骨髓間充質干細胞向成骨細胞轉化。[方法]采用不同時間點、不同濃度DHEA藥物刺激人骨髓間充質干細胞,進行時間和濃度依賴試驗,并采用生物化學和小分子酶抑制劑去闡明DHEA在人骨髓間充質干細胞中調節(jié)IGF-I基因表達并促進其向成骨分化的機制。在本實驗研究,應用PKA信號通路抑制劑H-89, PKC信號通路抑制劑CHE,JNK信號通路抑制劑SP600125分別阻斷PKA信號通路,PKC信號通路,JNK信號通路。應用P13K信號通路抑制劑LY294002,P38 MAPK信號通路阻斷劑SB203580,P42/44信號通路阻斷劑PD098059, IGF-IR受體阻斷劑AG1024分別阻斷PI3K、P38 MAPK、P42/44 MAPK、IGF-IR信號通路。[結果]在骨髓間充質干細胞中,DHEA可上調IGF-I基因表達,并且存在時間和濃度依賴。IGF-I基因表達高峰期是在DHEA刺激后4-6小時；在刺激時間為6小時情況下,最佳藥物濃度為10nM。阻斷PI3K,P38 MAPK, P42/44 MAPK信號通路,DHEA上調IGF-1基因表達的作用被抑制。隨后樣本經(jīng)特殊酶抑制劑作用后,對成骨分化相關基因和堿性磷酸酶檢測均出現(xiàn)表達降低。[結論]DHEA可能經(jīng)過IGF-I信號通路,包括PI3K, P38 MAPK, P42/44 MAPK信號通路來上調人骨髓間充質干細胞中IGF-I基因表達并促進其向成骨方向分化。第三部分[目的]研究老齡化與1 α-羥化酶關系,并闡明DHEA在維生素D代謝中的作用機制。[方法]運用RT-PCR方法研究在人骨髓間充質干細胞中維生素D代謝關鍵酶1α-羥化酶的表達,并切分析年齡對其表達的影響。應用IGF-IR受體阻斷劑AG1024, CERB阻滯劑KG501分別阻斷IGF-1, CERB信號通路,從蛋白水平研究DHEA在維生素D轉化代謝中的作用機制。[結果]一組包括19例患者的樣本中,年齡從40到87歲,平均年齡56±11歲,研究發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增長,CYP27B1/1α-羥化酶的表達逐漸下降。老年組(年齡55歲,n=12)CYP27B1/1α-羥化酶表達是年輕組CYP27B1/1α-羥化酶表達(年齡50歲,n=7)的64.4%。在老年組和年輕組中,我們通過RT-PCR分別對250HD3或1,25(OH)2D3±DHEA對人骨髓間充質干細胞成骨分化的影響進行研究。在年輕組中,成骨誘導培養(yǎng)3d后,我們發(fā)現(xiàn)25OHD3,1,25(OH)2D3, DHEA均可以促進成成骨相關標志基因的表達,如堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)和骨涎蛋白(bone sialoprotein, BSP)。但在老年組中,250HD3對相關成骨標志基因刺激作用較弱。在老年組中,經(jīng)DHEA預處理后,250HD3和1,25(OH)2D3均可以誘導人骨髓基質干細胞向成骨方向分化。在人骨髓基質干細胞中,通過不同的小分子抑制劑的應用,發(fā)現(xiàn)cAMP反應元件結合蛋白(cAMP response element binding protein, CREB)和[GF-I分別介導了脫氫表雄酮調節(jié)CYP27B1的作用。通過應用小分子抑制劑AG-1024(一種IGF-IR的抑制劑),發(fā)現(xiàn)脫氫表雄酮上調CYP27B1的表達都是通過IGF-I的激活。而通過應用小分子抑制劑KG-501(特殊抑CREB的下游基因),發(fā)現(xiàn)脫氫表雄酮上調CYP27B1的表達同樣需要通過CREB的激活。由此推測CYP27B1上調則是由于DHEA激活的IGF-I信號系統(tǒng),繼發(fā)激活CREB所介導的。[結論]1α-羥化酶/CYP27B1的表達及活性隨著人年齡的增長而下降。脫氫表雄酮可能上調IGF-I,從而激活CREB,最終上調CYP27B1,增強人骨髓間充質干細胞對于25OHD3的反應能力,從而增強其成骨分化能力。
[Abstract]:The first part of human bone marrow mesenchymal stem cells in vitro culture and identification of [Objective] by laboratory has successfully created human bone marrow mesenchymal stem cell culture solution, separation, culture and identification of hMSCs, provide sufficient dry by density gradient centrifugation to isolate mononuclear cells. Methods for the follow-up study source, cell the adherent method in a -MEM medium primary hMSCs medium, then were cultured on the differentiation of osteoblasts. Alkaline phosphatase activity assay and Alizarin Red S staining; on adipocyte differentiation using Oil Red-O staining method was used to identify the application of Alcian; blue staining of chondrocytes were identified. Results: bone marrow cells after 6-24 hours, the cell body shape gradually into triangular or irregular shape. The culture of 2-4 days between the morphology of mesenchymal cells changed, the cells gradually turned into fiber The spindle cell type, and gathered into the colony; 7-14 days in culture, cells covered with 70%-80% culture bottle bottom area, cells arranged more closely, the bone marrow mesenchymal stem cells into single cells. The cells were adipogenicdifferentiation, can detect the different shapes of Oil Red-O positive staining cell formation; osteoblast differentiation, detection of alkaline phosphatase activity, and Alizarin Red S staining positive cells formation; the chondrogenic differentiation was seen after Alcian blue staining positive cells. Conclusion] forming method used in this experiment can be successfully isolated, cultured and amplified in human bone marrow mesenchymal stem cells, and identify its osteogenic adipogenic, chondrogenic differentiation ability, part DHEA. Up regulation of IGF-I gene second expression and promotes the osteoblast differentiation of hMSCs [Objective] this study tested whether DHEA by adjusting IGF-I to promote bone marrow mesenchymal stem cells into Bone cell transformation. By using different time points, DHEA concentrations stimulate human bone marrow mesenchymal stem cells, the time and concentration dependent tests, and the biochemical and molecular enzyme inhibitors to elucidate DHEA in human bone marrow mesenchymal stem cells in regulating IGF-I gene expression and its mechanism to promote osteogenesis differentiation. In this study, the application of PKA signaling pathway inhibitor H-89, PKC inhibitor of CHE signaling pathway, JNK signaling pathway inhibitor SP600125 were used to block PKA signaling pathway, PKC signaling pathway, JNK signaling pathway. P13K signaling pathway inhibitor LY294002, P38 MAPK signal pathway inhibitor SB203580 P42/44 signal pathway inhibitor PD098059, IGF-IR blocking PI3K receptor antagonist AG1024, P38 MAPK, P42/44 MAPK, IGF-IR signaling pathway. Results in bone marrow mesenchymal stem cells, DHEA can upregulate the expression of IGF-I gene, and the presence of time And concentration dependent expression of.IGF-I gene in DHEA is the peak 4-6 hours after stimulation; the stimulation time was 6 hours, the best concentration was 10nM. PI3K P38 MAPK, P42/44 block, MAPK signaling pathway, the expression of DHEA gene suppressed the upregulation of IGF-1. Then the samples by special enzyme inhibitors after the action of bone differentiation related gene and alkaline phosphatase assay showed decreased expression. Conclusion]DHEA may be through the IGF-I pathway, including PI3K, P38, MAPK, P42/44, MAPK signaling pathway to increase human bone marrow mesenchymal stem cells in IGF-I gene expression and promote osteogenic differentiation. The third part to study the aging and the relationship between the 1 alpha hydroxylase the expression, and clarify mechanism. Methods DHEA in vitamin D metabolism in the use of RT-PCR method in human bone marrow mesenchymal stem cells in vitamin D metabolism key enzyme 1 alpha hydroxylase, and Analysis of the effect of age on its expression. The application of IGF-IR receptor antagonist AG1024, CERB inhibitor KG501 were used to block IGF-1, CERB signaling pathway, from the study of DHEA protein level conversion mechanism. Results in the metabolism of vitamin D in a group of samples including 19 patients, aged from 40 to 87 years old, the average age of 56. At the age of 11, the study found that with the increase of age, the expression of CYP27B1/1 alpha hydroxylase decreased gradually. The elderly group (age 55, n=12 CYP27B1/1) alpha hydroxylase expression is CYP27B1/1 hydroxylase expression in young group (aged 50, n=7 64.4%.) in the elderly group and the young group, we separately by RT-PCR on 250HD3 or 1,25 (OH) 2D3 + DHEA to study the effect of human bone marrow mesenchymal stem cell into osteogenic differentiation. In young group, osteoblast induced 3D, we found that 25OHD3,1,25 (OH) 2D3, DHEA can promote osteoblast related gene expression signature, Such as alkaline phosphatase (alkaline phosphatase, ALP) and bone sialoprotein (bone sialoprotein, BSP). But in the old group, 250HD3 of osteoblast marker gene stimulation is weak. In the older group, treated with DHEA, 250HD3 and 1,25 (OH) 2D3 can stem cells to differentiate into osteoblasts induction of human bone marrow stromal. In human bone marrow stromal stem cells, through the application of small molecule inhibitors of different cAMP response element binding protein (cAMP response element binding protein, CREB and [GF-I respectively) mediated by dehydroepiandrosterone regulates CYP27B1 function. Through the application of small molecule inhibitors of AG-1024 (an inhibitor of IGF-IR), found that the expression of dehydroepiandrosterone up-regulated the expression of CYP27B1 is through the activation of IGF-I. Through the application of small molecule inhibitors of KG-501 (gene special inhibition of CREB), found that the expression of dehydroepiandrosterone up-regulated CYP27B1 also need to pass After the activation of CREB. The results indicated that CYP27B1 increase is due to the activation of DHEA IGF-I signaling system, the expression and activity of secondary activation mediated by CREB. Conclusion]1 hydroxylase /CYP27B1 decreased with age. DHEA may upregulate IGF-I, which activates CREB, the upregulation of CYP27B1, enhancement of human bone marrow mesenchymal stem cells for the reaction ability of 25OHD3, so as to enhance the capability of osteogenic differentiation.

【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R68

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本文編號：1710412