本文選題：人臍帶間充質(zhì)干細胞　切入點：血管緊張素Ⅱ　出處：《天津醫(yī)科大學》2016年碩士論文

【摘要】：目的:人臍帶間充質(zhì)干細胞(human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells,h UCMSCs)作為一種較新型的MSCs,其移植對于各類損傷的組織器官有良好的修復作用,因此也成為干細胞研究領域的熱點之一。但研究發(fā)現(xiàn),h UCMSCs移植后會受到機體內(nèi)環(huán)境的影響,生物學特性發(fā)生改變,進而影響其修復效果。那么,如何能夠處理h UCMSCs,使其更適應機體內(nèi)環(huán)境,發(fā)揮更好的組織修復作用是近來的研究熱點,也是本研究的重點。損傷組織局部微環(huán)境中RAS系統(tǒng)的激活致使血管緊張素-Ⅱ(Angiotensin-Ⅱ,Ang-Ⅱ)持續(xù)生成,影響著內(nèi)、外源性MSCs的生物學活性及功能。有研究表明,高濃度Ang-Ⅱ可誘導MSCs、人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelia cells,HUVEC)等多種細胞發(fā)生損傷、凋亡、甚至死亡,而低濃度Ang-Ⅱ預處理MSCs后,則可顯著提高其耐缺氧能力,促進多種細胞因子的分泌。在旁分泌的多種細胞因子中,血管內(nèi)皮細胞因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是含量較高且發(fā)揮修復治療作用的關鍵因子,其通過與特異性受體(VEGFR2)結合,激活下游信號而發(fā)揮抗細胞凋亡、促細胞增殖以及新生血管生成的作用,進而修復重建各類損傷的組織器官。在前期實驗和查閱文獻的基礎上,本研究擬通過使用適宜濃度Ang-Ⅱ預處理體外培養(yǎng)的h UCMSCs,再將預處理后的h UCMSCs(Ang-Ⅱ-MSCs)移植于全層皮膚缺損動物模型,觀察其對創(chuàng)面修復重建的效果,以及深入研究Ang-Ⅱ-MSCs促創(chuàng)面愈合的機制。從而為干細胞用于臨床治療多種創(chuàng)面提供的研究基礎。方法:(1)Ang-Ⅱ?qū) UCMSCs生物學特性的影響:將培養(yǎng)的h UCMSCs隨機分為4組:0ng/m L Ang-Ⅱ組(A組)、100ng/m L Ang-Ⅱ組(B組)、500ng/m L Ang-Ⅱ組(C組)和1000ng/m L Ang-Ⅱ組(D組)。倒置相差顯微鏡觀察細胞的形態(tài)和生長融合的情況;CCK8法檢測細胞的增殖情況;AO-EB染色法檢測細胞的凋亡情況;流式細胞儀檢測細胞的增殖周期和細胞的凋亡率。ELISA檢測上清液中VEGF、b FGF和HGF的含量。(2)Ang-Ⅱ預處理的h UCMSCs(Ang-Ⅱ-MSCs)促進創(chuàng)面愈合的初步探索:實驗分為3組:將18-20kg雄性巴馬小型豬背部切取三個5cm×5cm大小的正方形的創(chuàng)面,制備全層皮膚組織缺損模型。選取創(chuàng)面的9個點,通過局部注射的方式分別含有Ang-Ⅱ-MSCs(1×107/1 m L ECM)、MSCs(1×107/1 m L ECM)Control(1m L ECM)的1ml培養(yǎng)基注入相應全層皮膚缺損模型創(chuàng)面。Image Pro Plus軟件評估各組創(chuàng)面的愈合率,記錄創(chuàng)面的愈合時間。組織化學染色檢測各組創(chuàng)面組織的整體結構、新生微血管的數(shù)量、膠原的排列情況以及角質(zhì)蛋白K19(CK19)的表達情況。(3)Ang-Ⅱ預處理后h UCMSCs的上清液(Ang-Ⅱ-CM)對人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)增殖、凋亡及血管形成的影響機制研究:首先將培養(yǎng)的HUVEC分為3組:培養(yǎng)基組(CM)、MSCs條件培養(yǎng)基組(MSCs-CM)、100ng/m L Ang-Ⅱ預處理后MSCs條件培養(yǎng)基組(Ang-Ⅱ-CM),研究Ang-Ⅱ-CM對HUVEC的增殖、凋亡的影響。選用1000ng/m L Ang-Ⅱ致HUVEC損傷,制備凋亡模型。倒置相差顯微鏡觀察各組細胞的形態(tài);CCK8法檢測各組細胞的增殖情況;AO-EB、Hoechst染色法、流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡情況;Western Blot檢測各組細胞Caspase-3、bcl-2的表達情況,體外血管生成實驗檢測各組細胞血管形成能力。在Ang-Ⅱ-CM對HUVEC的增殖、凋亡影響研究結果的基礎上,深入探討h UCMSCs旁分泌的VEGF對HUVEC的保護機制,本實驗繼續(xù)分為以下6組:si RNA-Control+CM、si RNA-Control+MSCs-CM、si RNA-Control+Ang-Ⅱ-CM、si VEGFR2+CM、si VEGFR2+MSCs-CM、si VEGFR2+Ang-Ⅱ-CM。流式細胞儀檢測細胞的凋亡率;Western Blot檢測Caspase-3、bcl-2的表達情況;體外血管生成實驗檢測細胞的血管形成情況。結果:(1)Ang-Ⅱ?qū) UCMSCs生物學特性的影響:與0 ng/m L組相比,500 ng/m L組和1000 ng/m L組中h UCMSCs的形態(tài)結構均發(fā)生改變,凋亡細胞的數(shù)目較多,增殖活性較低,上清中細胞因子水平也均較低,且1000 ng/m L組最為顯著。而100ng/m L組h UCMSCs形態(tài)和結構均正常,未見凋亡細胞或死亡細胞,且100ng/m L組細胞的增殖活性和分泌的細胞因子均顯著高于0 ng/m L組、500 ng/m L組和1000 ng/m L組。因此,我們篩選100ng/m L Ang-Ⅱ進行預處理h UCMSCs。(2)Ang-Ⅱ預處理的h UCMSCs(Ang-Ⅱ-MSCs)促進創(chuàng)面愈合的初步探索:在Control組、MSCs組和Ang-Ⅱ-MSCs組中,Control組創(chuàng)面的愈合效果最差,Ang-Ⅱ-MSCs組最好。三組創(chuàng)面的愈合時間分別為:55±3d、47±3d和40±3d,Ang-Ⅱ-MSCs組創(chuàng)面的愈合時間最短。在35d時,三組創(chuàng)面的愈合率分別為(63±4)%、(75±4)%和(88±5)%,Ang-Ⅱ-MSCs組創(chuàng)面的愈合率最高,且該組創(chuàng)面組織的結構較完整,新生微血管數(shù)量較多、膠原排列更規(guī)整以及上皮化的程度更佳。(3)Ang-Ⅱ預處理后的h UCMSCs上清液(Ang-Ⅱ-CM)對人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)增殖、凋亡、新生血管影響的機制研究:Ang-Ⅱ-CM對HUVEC增殖、凋亡、新生血管影響的研究結果表明,與CM組相比,Ang-Ⅱ-CM組與MSCs-CM組中HUVEC的形態(tài)和結構均較好,其中Ang-Ⅱ-CM組凋亡細胞或死亡細胞最少,血管形成數(shù)量和細胞的增殖活性最好,MSCs-CM組次之。兩組抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平均較CM組高,促凋亡蛋白Caspase-3的表達水平也較CM組低,而Ang-Ⅱ-CM組則更為顯著。進一步使用si RNA干擾HUVEC中VEGFR2后,結果顯示:與si RNA-Control組相比,si VEGFR2組中Bcl-2表達量降低,Caspase-3表達量增高。此外,si VEGFR2組中凋亡細胞數(shù)量也較si RNA-Control組顯著增加,而新生微血管的數(shù)量則顯著減少。因此,VEGF和VEGFR2以及下游調(diào)控的Caspase-3和Bcl-2信號是h UCMSCs發(fā)揮促內(nèi)皮細胞增殖、抗內(nèi)皮細胞凋亡以及促內(nèi)皮新生微血管的潛在機制。結論:綜上所述,適宜濃度(100ng/m L)Ang-Ⅱ預處理的h UCMSCs可促進其的增殖、減少凋亡,通過旁分泌高水平的VEGF,與內(nèi)皮細胞上的VEGFR2結合,抑制下游的促凋亡蛋白Caspase-3和增加抗凋亡蛋白Bc-2的表達,發(fā)揮進促內(nèi)皮細胞存活、增殖和抗內(nèi)皮細胞凋亡能的作用,進而顯著促進了豬全層皮膚缺損性創(chuàng)面的愈合。
[Abstract]:Objective : Human umbilical cord mesenchymal stem cells ( hUCMSCs ) were used as a new type of MSCs . The transplantation of human umbilical vein endothelial cells ( hUCMSCs ) was one of the hot spots in the research of stem cells . Methods : ( 1 ) The effect of Ang - 鈪，

本文編號：1672457