本文選題：HDAC　切入點：i　出處：《第二軍醫(yī)大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：背景馬尾神經綜合征(CES)病程發(fā)病急、致殘率高,一直作為腰椎疾病的一大難題難以攻破。馬尾神經因其特殊的解剖結構,生理上易受到機械性損傷,并且一旦臨床上出現鞍區(qū)感覺缺失、腸道功能紊亂以及性功能障礙等惡化癥狀后,手術治療預后效果很差,多數患者殘留有膀胱或肛門括約肌的功能障礙,給患者及其家屬帶來沉重的精神壓力和經濟負擔。目前臨床上采用的藥物對癥治療和手術方法均未取得良好效果,臨床研究少有突破。因此,尋求一種新的有效治療馬尾神經損傷的方法顯得尤為重要。核小體中,組蛋白乙�；�(HAT)和組蛋白去乙�；�(HDAC)共同調節(jié)組蛋白的乙酰化水平,維持組蛋白乙�；�(wěn)態(tài)。由于與基因的轉錄、表達、抑制和細胞的增殖、分化關系密切,HDAC已經作為腫瘤靶標在臨床中得到廣泛應用。同時,隨著廣大學者對HADC及HDACi的深入研究發(fā)現,除腫瘤領域外,HDACi對中樞神經系統的疾病也有治療效果。已有研究證實了組蛋白去乙�；敢种苿�(HDACi)的神經保護作用,它影響著突觸活性和神經元的功能。但目前關于HDACi應用于馬尾神經損傷的研究尚未見相關報道。本項研究在以往實驗基礎上構建并改進了大鼠馬尾神經壓迫損傷的模型;其次將HDACi經皮下注入急性馬尾神經壓迫損傷的大鼠體內,以期恢復組蛋白乙�；腿ヒ阴；g的平衡狀態(tài),調節(jié)基因轉錄障礙,從而達到保護馬尾神經功能的目的;最后,應用RNA-seq研究大鼠馬尾神經壓迫損傷給予HDACi治療后轉錄組基因表達變化,通過分析數據,探究其深層次的分子機制,期望從中發(fā)現HDACi對于馬尾神經壓迫損傷保護作用的作用靶點。研究目的建立并改進大鼠馬尾神經壓迫損傷的模型;證實HDACi對大鼠急性馬尾神經壓迫損傷的保護作用;利用RNA-seq手段研究大鼠馬尾神經壓迫損傷給予HDACi治療后轉錄組基因表達變化,通過分析數據,探究其深層次的分子機制,為進一步研究馬尾神經損傷保護修復機制提供實驗基礎,以期在馬尾神經綜合征的治療中開拓新的研究方向。研究方法1、選取20只出生6周左右、體重約250克的實驗SD大鼠,隨機分為3組:模型組,n=8;假手術組,n=6;對照組,n=6。模型組大鼠在L4處咬除椎骨背脊,用電鉆在咬除部位鉆一1.2mm小孔,鉆透椎板,將一長10.0mm、厚1.1mm、寬1.0mm的硅膠條沿小孔置入椎管遠端,壓迫l5及l(fā)6段馬尾神經。假手術組僅在l4椎板上鉆孔,未置入硅膠條。模型建立3天后,運用馬尾神經壓迫損傷模型的bbb評分、斜板實驗評分判定各實驗組動物行為學改變。在術后設置時間點取材,運用he染色、lfb染色、tunel染色、免疫熒光組織染色判定各實驗組動物的組織病理學變化,確定模型建立成功。2、選取30只出生6周左右、體重約250克的實驗sd大鼠,隨機分為3組:實驗組(注入vpa組),n=10;對照組(注入生理鹽水組),n=10;假手術組,n=10。設計在實驗組和對照組兩組每只大鼠l4椎板上鉆孔,并置入硅膠條,假手術組僅鉆孔,不置入硅膠條。實驗組術前2h經皮下注入vpa(300mg/kg),造模后實驗組給予vpa(300g/kg,2/d),對照組注入等量生理鹽水。在大鼠造模前2h及術后連續(xù)7d采集大鼠bbb評分、斜板試驗評分。在術后7d,取大鼠的馬尾神經組織進行免疫熒光染色、he染色和lfb染色,取大鼠的背根神經節(jié)(drg)組織進行tunel染色,取大鼠受損馬尾神經近段的脊髓圓錐組織進行tunel染色。3、借助于最新的高通量測序技術,rna-seq來檢測實驗組與對照組對應節(jié)段馬尾神經組織的基因表達差異,通過分析數據,初步找到與hdaci保護馬尾神經壓迫損傷作用機制高度相關的關鍵分子和信號通路。結果1、成功地建立并改進大鼠馬尾神經壓迫損傷模型。2、本次研究中,檢測動物模型行為學的bbb評分、斜板實驗評分結果提示,vpa注入后,實驗組的下肢運動功能較對照組有明顯的改善,組織病理學結果提示,實驗組馬尾神經的神經纖維華勒變性和脫髓鞘病變明顯減輕,免疫熒光組織染色可以觀察到實驗組較對照組髓鞘化增多。tunel染色發(fā)現,實驗組中脊髓前角細胞神經元和drg神經元細胞凋亡數量明顯減少。3、通過分析大鼠馬尾神經壓迫損傷應用hdaci治療后的差異基因表達及初步驗證,篩選出hdac11,il18,fgf1,fgf5等差異表達基因,其中hdac11在vpa作用后存在高表達,il18在vpa作用后表達下降,fgf1在vpa作用后存在高表達,fgf5在vpa作用后存在表達下降。通過目前通用的keggpathway富集分析,發(fā)現了以下一些高度相關信號通路:mapk-jnk、p38mapk、calciumchannel、grb2-ras-mapk-erk、neuroactiveligand-receptorinteraction。結論本實驗所建立的大鼠馬尾神經壓迫損傷模型設計合理、方便操作、可復制性強。能夠真實有效地模擬引起馬尾神經損傷的臨床常見致病因素-腰椎間盤突出的致病過程。hdaci對大鼠急性馬尾神經壓迫損傷起到一定的保護作用,它可以改善馬尾神經壓迫損傷后的運動功能障礙、減少神經元凋亡、促進神經損傷后軸突再生。因此,HDACi是一種具有重大潛力的可配合臨床減壓手術有效改善患者預后功能的藥物治療措施。通過RNA-seq進行生物信息學分析和初步驗證,結合KEGG Pathway富集分析,我們篩選出了與HDACi保護馬尾神經壓迫損傷的作用機制高度相關的關鍵分子及信號通路:HDAC11,IL18,FGF1,FGF5,MAPK-JNK、p38MAPK、calcium chanel、GRB2-Ras-MAPK-Erk、Neuroactive Ligand-Receptor Interaction。這些發(fā)現幫助我們加深對馬尾神經損傷病理機制及HDACi保護馬尾神經壓迫損傷作用機制的理解,將成為我們下一步深入研究的方向,希望可以找到高效治療馬尾神經損傷的關鍵作用靶點,開發(fā)精準分子治療手段,造福廣大馬尾神經綜合征患者。
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【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R681.5

【參考文獻】

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本文編號：1596927