本文關(guān)鍵詞：綠色工藝制備聚乙烯亞胺衍生物在細(xì)胞支架和介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染中的研究

  更多相關(guān)文章： 聚乙烯亞胺改性 復(fù)合納米纖維 細(xì)胞支架 基因載體 轉(zhuǎn)染

【摘要】：聚乙烯亞胺(polyethyleneimine, PEI)作為典型的陽離子聚合物之一，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于組織工程支架以及作為基因轉(zhuǎn)染的載體。由于PEI本身血液相容性較差，細(xì)胞毒性大等缺點(diǎn)嚴(yán)重制約了其進(jìn)一步應(yīng)用。利用化學(xué)方法對PEI分子改性是一種有效降低其細(xì)胞毒性和改善血液相容性的方法。生物材料通過靜電紡絲技術(shù)制備的具有極大比表面積的納米纖維可以很好地模擬天然細(xì)胞外基質(zhì)，為細(xì)胞的粘附、增殖及為生理功能提供良好的微環(huán)境。 本論文結(jié)合兩性離子化合物良好的生物相容性優(yōu)勢，設(shè)計(jì)合成兩性離子化合物PEI衍生物。利用高壓靜電紡絲技術(shù)制備PEI-C/聚乙烯醇(polyvinyl alcohol, PVA)的低毒復(fù)合納米纖維，考察其纖維性能和細(xì)胞毒性；研究改性后的PEI(PEI-C)作為基因載體時(shí)在水溶液中與質(zhì)粒DNA(Plasmid deoxyribonucleic acid, pDNA)之間的相互作用、納米復(fù)合物的形成、載體的生物相容性、細(xì)胞毒性及基因復(fù)合物在體外的轉(zhuǎn)染等性能。 本論文的研究內(nèi)容主要分為以下幾個(gè)方面： （1）利用綠色化學(xué)的理念，基于富氨基類聚合物對二氧化碳有很強(qiáng)的吸附性這一特點(diǎn)，結(jié)合兩性離子化合物良好的生物相容性的優(yōu)勢，用二氧化碳對超支化PEI25KDa進(jìn)行改性，制備出聚乙烯亞胺衍生物(PEI-C)。通過核磁（NMR）、元素含量檢測和傅氏轉(zhuǎn)換紅外線光譜分析儀（FT-IR）對所制備的衍生物進(jìn)行表征確認(rèn)其結(jié)構(gòu)�？疾於趸嘉諘r(shí)間、PEI反應(yīng)濃度等影響因素，結(jié)果表明：PEI濃度控制在20%~40%之間；當(dāng)二氧化碳在通入0.5h后，PEI中氧元素含量已達(dá)到27%。MTT細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明，與未修飾的PEI25K相比，，PEI-C材料的細(xì)胞的相對存活率維持在80%左右；而PEI的細(xì)胞毒性隨其濃度增加，細(xì)胞存活率從80%左右降低到30%以下，表明PEI-C的細(xì)胞毒性顯著降低。 （2）采用靜電紡絲手段，將PEI-C和PVA制備成具有良好纖維形貌的含不同比例的PEI-C/PVA復(fù)合納米纖維，用戊二醛蒸汽交聯(lián)得到水穩(wěn)定的納米纖維膜。掃描電子顯微鏡（SEM）、FT-IR等手段表征其纖維膜交聯(lián)前后的形貌及結(jié)構(gòu)變化。通過對紡絲液濃度、電壓、接收距離和流速等條件的優(yōu)化，得到了具有良好纖維形貌的含不同比例的PEI-C/PVA復(fù)合納米纖維支架。以雪旺細(xì)胞（schwann cell）為模型細(xì)胞來研究該材料的生物相容性。研究表明，雪旺細(xì)胞在PEI-C/PVA復(fù)合纖維支架表面分布相比未改性的PEI/PVA復(fù)合纖維基質(zhì)更為密集，細(xì)胞形態(tài)明顯較好，更利于細(xì)胞生長；MTT細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，PEI-C/PVA在質(zhì)量比為35：65時(shí)，纖維支架細(xì)胞的OD值為0.47，相當(dāng)于同等條件下PEI/PVA纖維支架OD值的2倍，證實(shí)改性后的復(fù)合纖維支架的細(xì)胞毒性明顯降低。 （3）將所制備的PEI-C材料用于介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的研究。蛋白吸附實(shí)驗(yàn)表明二氧化碳修飾后的PEI-C材料抵御蛋白質(zhì)吸附的能力增強(qiáng)；脫氧核糖核酸酶I的防護(hù)和釋放實(shí)驗(yàn)表明，PEI-C載體材料有保護(hù)pDNA免受細(xì)胞中核酸酶降解并且可以釋放pDNA。使用凝膠電泳儀考察載體與pDNA的結(jié)合能力，采用動態(tài)光散射(DLS)和Zeta電位儀考察載體與pDNA形成的復(fù)合物的粒徑和電位。MTT細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明，與未修飾的PEI載體基因復(fù)合物(pDNA/PEI)相比，PEI-C載體基因復(fù)合物(pDNA/PEI-C)的細(xì)胞毒性顯著降低；體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明，PEI-C能夠有效地介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染。以Hepa1-6細(xì)胞和QBC939細(xì)胞為模型細(xì)胞，在有血清情況下，PEI-C作為載體時(shí)在Hepa1-6細(xì)胞和QBC939細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率為33%以上達(dá)到甚至高于PEI25KDa作為載體時(shí)的轉(zhuǎn)染效率。隨著N/P的增加，轉(zhuǎn)染效率從33%左右增長到62%左右；在無血清情況下轉(zhuǎn)染，其PEI-C作為載體在兩種癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率也維持在20%以上，比PEI25KDa作為載體時(shí)的轉(zhuǎn)染效率高2.5倍左右，激光共聚焦圖片也與其吻合。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PEI-C能夠有效地介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染。
【關(guān)鍵詞】：聚乙烯亞胺改性 復(fù)合納米纖維 細(xì)胞支架 基因載體 轉(zhuǎn)染
【學(xué)位授予單位】：東華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R318.08
【目錄】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-11
• 目錄11-13
• 第一章 緒論13-30
• 1.1 引言13
• 1.2 聚乙烯亞胺及其衍生物13-20
• 1.2.1 聚乙烯亞胺的性質(zhì)13-15
• 1.2.2 聚乙烯亞胺的應(yīng)用15-16
• 1.2.3 聚乙烯亞胺的改性16-20
• 1.3 納米纖維膜用于模擬細(xì)胞外基質(zhì)20-24
• 1.3.1 細(xì)胞外基質(zhì)生物材料的發(fā)展20-21
• 1.3.2 靜電紡絲概述21-22
• 1.3.3 靜電紡絲納米纖維膜的應(yīng)用22-24
• 1.4 介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染24-28
• 1.4.1 基因轉(zhuǎn)染簡介24-25
• 1.4.2 非病毒基因轉(zhuǎn)染載體25-27
• 1.4.3 高分子基因載體介導(dǎo)基因傳遞的一般過程27-28
• 1.5 本課題的提出及主要研究內(nèi)容28-29
• 1.6 本論文工作的創(chuàng)新之處在于以下幾個(gè)方面29-30
• 第二章 聚乙烯亞胺衍生物的制備及表征30-41
• 2.1 引言30-31
• 2.2 實(shí)驗(yàn)部分31-34
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)原料及儀器31
• 2.2.2 綠色合成聚乙烯亞胺衍生物 PEI-C31
• 2.2.3 13C NMR 核磁分析31-32
• 2.2.4 全反射傅里葉紅外光譜儀（ATR-FTIR）分析32
• 2.2.5 熱重(TG)分析32
• 2.2.6 元素分析32-33
• 2.2.7 PEI-C 材料的 MTT 實(shí)驗(yàn)33-34
• 2.3 結(jié)果與討論34-40
• 2.3.1 PEI-C 的結(jié)構(gòu)分析34-38
• 2.3.2 PEI-C 細(xì)胞毒性評價(jià)38-40
• 2.4 總結(jié)40-41
• 第三章 PEI-C/PVA 復(fù)合納米纖維的制備及表征41-54
• 3.1 前言41-42
• 3.2 實(shí)驗(yàn)部分42-45
• 3.2.1 實(shí)驗(yàn)原料及儀器42
• 3.2.2 靜電紡制備 PEI-C/PVA 和 PEI/PVA 復(fù)合納米纖維42-44
• 3.2.3 PEI-C/PVA 和 PEI/PVA 復(fù)合納米纖維膜疏水化處理44
• 3.2.4 PEI-C/PVA 和 PEI/PVA 復(fù)合納米纖維膜的表征44
• 3.2.5 復(fù)合納米纖維膜體外細(xì)胞毒性檢測44-45
• 3.3 結(jié)果與討論45-53
• 3.3.1 復(fù)合納米纖維膜細(xì)胞毒性的研究45-51
• 3.3.2 體外細(xì)胞生長和細(xì)胞毒性試驗(yàn)51-53
• 3.4 本章小結(jié)53-54
• 第四章 PEI-C/pDNA 復(fù)合體的制備及在轉(zhuǎn)染方面的應(yīng)用54-68
• 4.1 引言54-55
• 4.2 實(shí)驗(yàn)部分55-59
• 4.2.1 實(shí)驗(yàn)原料及儀器55
• 4.2.2 酸堿滴定55-56
• 4.2.3 RFP 質(zhì)粒 DNA 的提取56-57
• 4.2.4 pDNA/PEI-C 復(fù)合物的制備57
• 4.2.5 pDNA/PEI-C 復(fù)合物凝膠電泳實(shí)驗(yàn)57
• 4.2.6 pDNA/PEI-C 復(fù)合物粒徑、表面電荷的測試57
• 4.2.7 透射電鏡（TEM）57
• 4.2.8 蛋白質(zhì)吸附實(shí)驗(yàn)57-58
• 4.2.9 DNase I 的保護(hù)和釋放實(shí)驗(yàn)58
• 4.2.10 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)58-59
• 4.2.11 體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)59
• 4.3 結(jié)果與討論59-67
• 4.3.1 PEI-C 聚合物質(zhì)子緩沖能力的研究59-60
• 4.3.2 PEI-C 聚合物與 pDNA 結(jié)合能力的研究60-61
• 4.3.3 pDNA/PEI-C 復(fù)合物粒徑和電位的研究61-62
• 4.3.4 PEI-C 聚合物與蛋白質(zhì)吸附作用62-63
• 4.3.5 PEI-C 聚合物對 DNA 的保護(hù)作用63-64
• 4.3.6 pDNA/PEI-C 復(fù)合物的細(xì)胞毒性評價(jià)64-65
• 4.3.7 體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染評價(jià)65-67
• 4.4 本章小結(jié)67-68
• 第五章 總結(jié)與展望68-70
• 5.1 總結(jié)68-69
• 5.2 展望69-70
• 參考文獻(xiàn)70-81
• 碩士期間發(fā)表的論文和專利81-83
• 致謝83

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 盧麗萍;王芳芳;吳敏;;聚乙烯醇/殼聚糖/硝酸鈰共混纖維氈的制備及其對Cr(Ⅵ)的吸附性能[J];紡織學(xué)報(bào);2012年05期

2 張穎 ,王志 ,王世昌;Facilitated Transport of CO_2 Through Synthetic Polymeric Membranes[J];Chinese Journal of Chemical Engineering;2002年05期

本文編號：646205