發(fā)布時(shí)間：2017-07-01 05:14

  本文關(guān)鍵詞：原花青素交聯(lián)彈性蛋白的性能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目前,心血管疾病的發(fā)病率和致死率在所有疾病中位列第一,因此對(duì)用于心血管疾病治療的人工心臟瓣膜和血管替代品的需求很大。臨床上采用戊二醛(Glutaraldehyde, GA)作為交聯(lián)劑制備得到的心臟瓣膜以及血管雖然具有一定的抗菌、抗炎功能。但是也存在一些嚴(yán)重的缺陷,例如：柔軟程度不夠,容易鈣化和不易再細(xì)胞化等。因此,迫切需要尋找新的交聯(lián)方法以克服GA交聯(lián)所造成的缺點(diǎn)。 原花青素(procyanidins, PC)是紅酒、水果和蔬菜中的黃酮類多酚,具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗血栓等功效。此外,與一些有毒的化學(xué)交聯(lián)劑相比,PC沒有急性和亞急性毒性,其體內(nèi)代謝途徑清楚。前期本實(shí)驗(yàn)室己證明PC通過多酚羥基與脫細(xì)胞心臟瓣膜ECM的脯氨酸之間形成氫鍵交聯(lián),并且在1mg/mL時(shí)就能夠有效抑制瓣膜ECM鈣化。研究顯示pH中性環(huán)境下,PC既能與彈性蛋白結(jié)合又能與膠原蛋白結(jié)合形成氫鍵,隨著pH值的下降,其逐漸轉(zhuǎn)向主要與彈性蛋白的結(jié)合。而彈性蛋白又是脫細(xì)胞瓣膜良好彈性的保障,是維持其柔順性的關(guān)鍵,能夠調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附生長(zhǎng)以及平滑肌細(xì)胞向內(nèi)長(zhǎng)入,也是ECM鈣化的起始位點(diǎn)。因此本研究就柔順性、抗鈣化和再細(xì)胞化三個(gè)主要方面,對(duì)PC最佳交聯(lián)條件進(jìn)行詳細(xì)探究,并且針對(duì)PC交聯(lián)純彈性蛋白的鈣化抑制效果、抗鈣化機(jī)理以及具體作用靶點(diǎn)進(jìn)行深入探討。 采用PC在不同酸性條件下交聯(lián)脫細(xì)胞心臟瓣膜,以期尋找最佳交聯(lián)條件,從而保持脫細(xì)胞瓣膜的柔順度、抑制鈣化并同時(shí)保持良好的生物相容性。結(jié)果顯示,pH6.0交聯(lián)條件下制備的脫細(xì)胞心臟瓣膜能夠維持瓣膜的天然形態(tài),顯示出類似于天然脫細(xì)胞瓣膜的柔順程度及其他力學(xué)性能；能有效抑制瓣膜ECM的鈣化；具有良好的細(xì)胞相容性和抗血栓性能。 采用PC交聯(lián)純的彈性蛋白支架,以期明確PC是否能夠抑制彈性蛋白所引起的鈣化,相應(yīng)的抗鈣化機(jī)理以及具體作用靶點(diǎn)。此外也首次探討了PC交聯(lián)純的彈性蛋白的相關(guān)生物學(xué)特性,用作組織工程帶瓣管道的可能性。結(jié)果顯示,PC能夠抑制由彈性蛋白引起的鈣化,其抗鈣化機(jī)制為：PC交聯(lián)降低了基質(zhì)材料的免疫原性,抑制巨噬細(xì)胞遷入,抑制MMPs和TNF-a的分泌及活性,從而一方面保護(hù)彈性蛋白不被MMPs降解,阻斷鈣化；另一方面,阻斷細(xì)胞因成骨分化而引起的鈣化。另外,PC可以通過與彈性蛋白的陰離子氨基酸基團(tuán)之間進(jìn)行更充分的氫鍵交聯(lián),從而封閉彈性蛋白中潛在的鈣化成核位點(diǎn),阻斷鈣化。PC交聯(lián)的彈性蛋白支架具備良好的血液相容性、抗血栓和抗炎潛能,滿足了組織工程帶瓣管道的關(guān)鍵要求。具備利于再細(xì)胞化的孔隙結(jié)構(gòu)及孔隙率,為組織工程支架,特別是帶瓣管道提供了良好的選擇。 在上述基礎(chǔ)上,采用PC在不同pH條件下交聯(lián)彈性蛋白,以既能抗鈣化,又能使彈性蛋白保持柔軟為指標(biāo),篩選PC對(duì)彈性蛋白的最佳交聯(lián)條件,從而制備出具有理想柔順度和生物學(xué)性能的組織工程支架。結(jié)果顯示,1mg/mL PC在弱酸性條件下(pH6.0)能夠更充分地交聯(lián)彈性蛋白組分,獲得更優(yōu)柔順度的彈性蛋白支架,該支架具有快速再細(xì)胞化潛能,良好的血液相容性以及抗鈣化性能。
【關(guān)鍵詞】：原花青素 彈性蛋白 交聯(lián) 柔順性 再細(xì)胞化 抗鈣化
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R318.08
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-15
• 第一章 原花青素在酸性條件下交聯(lián)制備脫細(xì)胞心臟瓣膜的柔順度、抗鈣化及相容性15-36
• 引言15-16
• 1 材料與試劑16-17
• 1.1 材料16
• 1.2 試劑16-17
• 1.3 儀器17
• 2 實(shí)驗(yàn)方法17-21
• 2.1 脫細(xì)胞心臟瓣膜的制備及PC交聯(lián)17-18
• 2.2 柔順度測(cè)定18
• 2.2.1 交聯(lián)脫細(xì)胞瓣膜的宏觀形貌和彎曲角(a)的統(tǒng)計(jì)分析18
• 2.2.2 拉伸強(qiáng)度和彈性模量測(cè)定18
• 2.3 體外抗鈣化能力測(cè)定18-19
• 2.3.1 掃描電鏡下能譜測(cè)定18-19
• 2.3.2 電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜定量測(cè)定鈣磷含量19
• 2.4 交聯(lián)脫細(xì)胞瓣膜的生物相容性檢測(cè)19-21
• 2.4.1 Ⅱ型膠原蛋白酶體外降解實(shí)驗(yàn)19
• 2.4.2 細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)19-20
• 2.4.3 血液相容性測(cè)定20-21
• 2.5 統(tǒng)計(jì)分析21
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果21-28
• 3.1 脫細(xì)胞及交聯(lián)后瓣膜的宏觀形貌和柔順度21-24
• 3.2 交聯(lián)脫細(xì)胞瓣膜的體外抗鈣化能力24-25
• 3.3 交聯(lián)脫細(xì)胞瓣膜的生物相容性25-28
• 3.3.1 體外Ⅱ型膠原蛋白酶降解穩(wěn)定性25-26
• 3.3.2 瓣膜間質(zhì)細(xì)胞黏附26-27
• 3.3.3 血液相容性27-28
• 4 討論28-31
• 5 結(jié)論31-32
• 參考文獻(xiàn)32-36
• 第二章 原花青素交聯(lián)彈性蛋白：抗鈣化及相關(guān)生物學(xué)性能36-69
• 引言36-37
• 1 材料與試劑37-39
• 1.1 材料37
• 1.2 試劑37-38
• 1.3 儀器38-39
• 2 實(shí)驗(yàn)方法39-45
• 2.1 主動(dòng)脈彈性蛋白的制備39
• 2.2 組織學(xué)分析以及掃描電鏡(SEM)觀察39-40
• 2.3 PC交聯(lián)40
• 2.4 交聯(lián)彈性蛋白支架的孔隙率及孔徑分布測(cè)定40
• 2.5 抗鈣化及其機(jī)理研究40-43
• 2.5.1 體內(nèi)抗鈣化能力測(cè)定40-41
• 2.5.2 體外巨噬細(xì)胞黏附及TNF-α分泌41
• 2.5.3 MMP-12免疫組化染色41-42
• 2.5.4 抗彈性蛋白酶(MMP-12)體外降解42
• 2.5.5 體外鈣鹽沉積測(cè)定42-43
• 2.6 細(xì)胞相容性43
• 2.6.1 體外細(xì)胞黏附43
• 2.6.2 體內(nèi)再細(xì)胞化43
• 2.7 血液相容性43-44
• 2.7.1 抗凝血實(shí)驗(yàn)43-44
• 2.7.2 血小板黏附實(shí)驗(yàn)44
• 2.7.3 溶血實(shí)驗(yàn)44
• 2.8 統(tǒng)計(jì)分析44-45
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果45-59
• 3.1 交聯(lián)主動(dòng)脈彈性蛋白形貌及孔隙率、孔徑分布45-47
• 3.2 交聯(lián)主動(dòng)脈彈性蛋白抗鈣化及其機(jī)理47-54
• 3.2.1 體內(nèi)抗鈣化能力測(cè)定47-49
• 3.2.2 抗巨噬細(xì)胞黏附及TNF-a分泌49-51
• 3.2.3 抗MMP-12分泌51-52
• 3.2.4 抗彈性蛋白酶(MMP-12)體外降解52
• 3.2.5 體外鈣化分析52-54
• 3.3 細(xì)胞相容性54-56
• 3.3.1 體外細(xì)胞黏附54-55
• 3.3.2 體內(nèi)再細(xì)胞化55-56
• 3.4 血液相容性56-59
• 3.4.1 抗凝血實(shí)驗(yàn)56-57
• 3.4.2 血小板黏附實(shí)驗(yàn)57-58
• 3.4.3 溶血實(shí)驗(yàn)58-59
• 4 討論59-63
• 5 結(jié)論63-64
• 參考文獻(xiàn)64-69
• 第三章 不同PH條件下原花青素交聯(lián)彈性蛋白支架的研究69-95
• 引言69-70
• 1 材料與試劑70-72
• 1.1 材料70
• 1.2 試劑70-71
• 1.3 儀器71-72
• 2 實(shí)驗(yàn)方法72-75
• 2.1 主動(dòng)脈彈性蛋白支架的制備及形貌分析72
• 2.2 PC交聯(lián)72
• 2.3 彈性模量及柔順度測(cè)定72-73
• 2.4 交聯(lián)穩(wěn)定性測(cè)試73
• 2.5 細(xì)胞相容性73-74
• 2.5.1 體外細(xì)胞黏附73
• 2.5.2 體內(nèi)再細(xì)胞化73-74
• 2.6 血液相容性74
• 2.7 體內(nèi)外抗鈣化能力分析74-75
• 2.7.1 體內(nèi)抗鈣化能力測(cè)定74
• 2.7.2 體外抗鈣化能力測(cè)定74-75
• 2.8 統(tǒng)計(jì)分析75
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果75-88
• 3.1 交聯(lián)主動(dòng)脈彈性蛋白的微觀形貌75-76
• 3.2 PH值對(duì)交聯(lián)彈性蛋白彈性模量的影響76-77
• 3.3 PC交聯(lián)穩(wěn)定性77-78
• 3.4 細(xì)胞相容性78-82
• 3.4.1 體外細(xì)胞黏附78-81
• 3.4.2 體內(nèi)再細(xì)胞化81-82
• 3.5 血液相容性82-84
• 3.6 體內(nèi)外抗鈣化能力分析84-88
• 3.6.1 體內(nèi)抗鈣化效應(yīng)84-86
• 3.6.2 體外抗鈣化效應(yīng)86-88
• 4 討論88-90
• 5 結(jié)論90-91
• 參考文獻(xiàn)91-95
• 第四章 文獻(xiàn)綜述95-110
• 參考文獻(xiàn)100-110
• 附錄110-111
• 致謝111-112

【共引文獻(xiàn)】

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