發(fā)布時(shí)間：2017-05-21 18:24

  本文關(guān)鍵詞：體外構(gòu)建血管化組織工程心肌的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的本研究用5-氮胞苷對獲取的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，內(nèi)皮生長培養(yǎng)基MV2（EGM-2MV）對獲取的骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，將誘導(dǎo)獲取的心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以2:1比例混合種植于Matrigel基質(zhì)膠上，進(jìn)行組織工程心肌的血管化，以探索在體外進(jìn)行血管化組織工程心肌構(gòu)建的可能性。 方法1骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及誘導(dǎo)：利用全骨髓貼壁培養(yǎng)的方法分離獲取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；5-氮胞苷作為誘導(dǎo)劑，對其向心肌細(xì)胞進(jìn)行定向誘導(dǎo)。誘導(dǎo)前后，免疫細(xì)胞化學(xué)法行細(xì)胞鑒定：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD29、CD44、CD34；心肌細(xì)胞表面標(biāo)志物cTnT。2骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及向內(nèi)皮細(xì)胞的誘導(dǎo)：取3周齡SD大鼠，分離出股骨、脛骨，等量淋巴細(xì)胞分層液分離，收集單個(gè)核細(xì)胞，通過EGM-2MV條件培養(yǎng)基對骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。通過CD31、CD34和CD133等表面標(biāo)志物的表達(dá)情況對細(xì)胞進(jìn)行鑒定。3體外構(gòu)建組織工程化心�。簩⒐撬柙葱孕募〖�(xì)胞用DAPI標(biāo)記、骨髓源性內(nèi)皮細(xì)胞用CM-dil標(biāo)記，實(shí)驗(yàn)組以2:1比例種植于Matrigel基質(zhì)膠并進(jìn)行共同培養(yǎng)；對照組以1:0的比例進(jìn)行種植培養(yǎng)。不同時(shí)間點(diǎn)觀察細(xì)胞復(fù)合體的形態(tài)，免疫熒光顯微鏡下和蘇木精-伊紅染色方法觀察兩種細(xì)胞的分布情況并進(jìn)行心肌細(xì)胞凋亡檢測。采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料選用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間對比采用t檢驗(yàn)，P值0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果1骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞原代細(xì)胞接種后少數(shù)細(xì)胞貼壁，形狀不規(guī)則，可呈多種形態(tài)，如：紡錘形、不規(guī)則形；之后細(xì)胞形態(tài)不斷變化，最終呈集落樣增殖，，細(xì)胞呈梭形并以放射狀或者漩渦狀形態(tài)向四周擴(kuò)增。細(xì)胞傳代后，混合雜細(xì)胞被清除，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分布均勻，形態(tài)單一，呈長梭形，且增殖明顯高于原代細(xì)胞。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD29、CD44陽性表達(dá)，CD34陰性表達(dá)。即胞漿中有棕黃色顆粒為陽性表達(dá)，反之為陰性。2P3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長狀況：接種第2天因胰酶消化作用及適應(yīng)新的生長環(huán)境細(xì)胞數(shù)稍有減少；第3天開始細(xì)胞數(shù)有所增長；到了第6天，細(xì)胞數(shù)明顯開始升高，說明此時(shí)細(xì)胞處于分裂增殖期；第9天時(shí)，細(xì)胞數(shù)達(dá)到最多。3獲取的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在心肌細(xì)胞的定向誘導(dǎo)過程的初期（24h后）部分細(xì)胞因5-氮胞苷的毒性作用而死亡，經(jīng)過1周的藥物誘導(dǎo)后可出現(xiàn)臨近細(xì)胞彼此融合；2周后，細(xì)胞呈圓柱形或多角形，細(xì)胞接觸緊密；4周后，細(xì)胞呈梭形，漩渦狀生長。誘導(dǎo)后細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色顯示cTnT陽性表達(dá)。通過細(xì)胞計(jì)數(shù)，確定誘導(dǎo)后細(xì)胞的陽性率在90%以上。4分離培養(yǎng)的大鼠骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞接種后細(xì)胞逐漸貼壁，呈小桿狀或梭形等多種形態(tài)。5天時(shí)為集落樣生長：中央細(xì)胞密集，周圍單層細(xì)胞放射狀羅列，2周時(shí)多數(shù)單層細(xì)胞為多角形，融合成片狀，呈所謂“鋪路石樣”外觀。細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色顯示CD31、CD34和CD133陽性表達(dá)。通過細(xì)胞計(jì)數(shù)，確定誘導(dǎo)后細(xì)胞的陽性率在90%以上。5第3代內(nèi)皮細(xì)胞生長曲線：接種第2天因胰酶消化作用及適應(yīng)新的生長環(huán)境細(xì)胞數(shù)未見增多，48小時(shí)后貼壁伸展，3天后開始大量增殖，5天后進(jìn)入對數(shù)生長期，細(xì)胞數(shù)明顯增多，8天以后增長趨勢逐漸減緩，趨于平穩(wěn)。6蘇木精-伊紅染色及熒光顯微鏡顯示心肌內(nèi)皮細(xì)胞/Matrigel基質(zhì)膠復(fù)合體內(nèi)細(xì)胞密度均勻，心肌細(xì)胞胞核呈藍(lán)色圓形熒光，內(nèi)皮細(xì)胞胞漿呈紅色熒光。7心肌細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)24h后，2:1組復(fù)合體可出現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞典型的“成血管現(xiàn)象”；1:0組可見細(xì)胞均勻生長，卻無“成血管現(xiàn)象”。8TUNEL細(xì)胞凋亡檢測顯示2:1組比1:0組的凋亡心肌細(xì)胞少。9通過血管計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，心肌內(nèi)皮細(xì)胞/Matrigel基質(zhì)膠組（12±2.69）形成的血管樣結(jié)構(gòu)明顯多于心肌細(xì)胞/Matrigel基質(zhì)膠組（1±0.79）。 結(jié)論1骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)5-aza誘導(dǎo)可以獲得陽性率較高的心肌細(xì)胞。2等量淋巴細(xì)胞分層液分離獲取骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞并用EGM-2MV條件培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，可以獲得活性好、陽性率高的骨髓源性內(nèi)皮細(xì)胞。3骨髓源性心肌細(xì)胞與骨髓源性內(nèi)皮細(xì)胞以2:1的比例聯(lián)合種植于Matrigel基質(zhì)膠共培養(yǎng)，可于體外成功構(gòu)建血管化組織工程心肌。
【關(guān)鍵詞】：血管化 心肌細(xì)胞 內(nèi)皮細(xì)胞 組織工程
【學(xué)位授予單位】：河北聯(lián)合大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R318.08
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 引言11-13
• 第1章 實(shí)驗(yàn)研究13-41
• 1.1 材料與方法13-20
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料13-16
• 1.1.2 實(shí)驗(yàn)方法16-20
• 1.1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析20
• 1.2 結(jié)果20-29
• 1.2.1 大鼠 BMSCs 細(xì)胞形態(tài)學(xué)及表面抗原檢測20-23
• 1.2.2 BMSCs 向心肌細(xì)胞誘導(dǎo)23-24
• 1.2.3 骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞形態(tài)學(xué)及相關(guān)抗原檢測24-26
• 1.2.4 細(xì)胞/Matrigel 基質(zhì)膠支架復(fù)合體26-27
• 1.2.5 細(xì)胞-支架材料復(fù)合體成血管能力的檢測27-28
• 1.2.6 TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測28-29
• 1.3 討論29-36
• 1.3.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及向心肌細(xì)胞的誘導(dǎo)分化30-32
• 1.3.2 骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞分離、培養(yǎng)及向內(nèi)皮細(xì)胞的誘導(dǎo)分化32-33
• 1.3.3 支架材料33-34
• 1.3.4 組織工程心肌的血管化34-36
• 1.4 結(jié)論36
• 參考文獻(xiàn)36-41
• 第2章 綜述 心肌組織工程的研究進(jìn)展41-52
• 2.1 心肌組織工程種子細(xì)胞來源41-43
• 2.2 心肌組織工程的支架材料43-45
• 2.3 工程化心肌組織的體外構(gòu)建45-46
• 2.4 工程化心肌組織的再血管化46-47
• 2.5 問題與展望47
• 參考文獻(xiàn)47-52
• 致謝52-53
• 導(dǎo)師簡介53-54
• 作者簡介54-55
• 學(xué)位論文數(shù)據(jù)集55

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前9條

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6 伍長學(xué);馬建e

本文編號：384475