本文關(guān)鍵詞：同種異體脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合β-磷酸三鈣支架修復(fù)兔橈骨大段骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：第一部分兔脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)、鑒定以及多向誘導(dǎo)分化研究目的：建立體外分離培養(yǎng)獲得兔脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞(rabbit adipose-derived mesenchymal stem cells, rADSCs)的方法,并對(duì)其形態(tài)學(xué)、生物學(xué)特性進(jìn)行觀察并對(duì)其表面標(biāo)志物進(jìn)行鑒定；將分離培養(yǎng)的rADSCs體外誘導(dǎo),使其向成骨、成脂方向分化,觀察其多向細(xì)胞分化的潛能。方法：切取兔頸背區(qū)皮下脂肪,用0.1%I型膠原酶消化法獲得兔脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞,進(jìn)行體外培養(yǎng),用胰蛋白酶消化法傳代擴(kuò)增。用CCK-8法細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)繪制細(xì)胞增殖曲線。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物。第4代rADSCs經(jīng)成脂誘導(dǎo)后,用油紅0染色,成骨誘導(dǎo)后,分別用茜素紅染色、堿性磷酸酶染色,觀察其成骨、成脂分化潛能。結(jié)果：rADSCs細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形漩渦樣貼壁生長(zhǎng),增殖能力強(qiáng)。將第4代rADSCs用分子流式細(xì)胞儀檢測(cè),可見(jiàn)CD29、CD90、CD44陽(yáng)性率高,而CD34和CD45陽(yáng)性率低。第4代rADSCs在誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)下分化為脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞,成脂誘導(dǎo)后的rADSCs經(jīng)油紅0染色呈陽(yáng)性結(jié)果,成骨誘導(dǎo)后的rADSCs經(jīng)堿性磷酸酶和茜素紅染色均呈陽(yáng)性結(jié)果。結(jié)論：來(lái)源于兔頸背區(qū)的皮下脂肪組織取材相對(duì)容易且可供取材的組織量大,脂肪組織內(nèi)細(xì)胞量充足,可簡(jiǎn)單進(jìn)行體外分離培養(yǎng)；兔脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞(rADSCs)在體外增殖速度快,能夠保持穩(wěn)定的傳代,直至第10代；ADSCs具有分化成骨細(xì)胞、成脂細(xì)胞等多向細(xì)胞分化的潛能,是組織工程骨理想的種子細(xì)胞。第二部分兔脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞在β-磷酸三鈣支架上體外共培養(yǎng),構(gòu)建rADSCs/ β-TCP骨組織工程復(fù)合體及體外成骨分化的研究目的： 將β-磷酸三鈣(β-Tricalcium phosphate,β-TCP)支架與經(jīng)傳代分離獲取的兔脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞在體外共培養(yǎng),構(gòu)建成rADSCs/β-TCP骨組織工程復(fù)合體,觀察在組織工程支架上rADSCs向成骨細(xì)胞分化的能力。方法：將體外分離培養(yǎng)的rADSCs接種于β-TCP支架上,從在β-TCP支架上加入細(xì)胞懸液開(kāi)始計(jì)時(shí),在細(xì)胞培養(yǎng)的第24h開(kāi)始,每24h至第7d進(jìn)行CCK-8檢測(cè)細(xì)胞在材料中的增殖情況,培養(yǎng)7d后用堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)測(cè)定試劑盒檢測(cè)細(xì)胞在材料內(nèi)表達(dá)ALP的情況,以rADSCs直接接種于12孔板培養(yǎng)貼壁生長(zhǎng)作為對(duì)照組,在相同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行細(xì)胞增殖以及ALP活性的檢測(cè),結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。將rADSCs細(xì)胞懸液接種于β-TCP支架上,在體外共培養(yǎng)3d和7d,在掃描電鏡下觀察其生長(zhǎng)情況。結(jié)果：經(jīng)CCK-8法檢測(cè),細(xì)胞在支架材料上增殖的結(jié)果示：各組的吸光度都隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸升高,與β-TCP支架共培養(yǎng)7d的細(xì)胞與對(duì)照組相比較,第2天、第5天細(xì)胞與支架材料共培養(yǎng)組和對(duì)照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,在支架材料上的細(xì)胞增殖能力較強(qiáng),其余時(shí)間點(diǎn)的兩組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；并且隨著時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞的增殖不受影響并具有良好的生物學(xué)活性。ALP活性測(cè)定結(jié)果表明,接種的rADSCs細(xì)胞在β-TCP支架上生長(zhǎng)良好,具有較高的ALP活性,與對(duì)照相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,β-TCP具有一定的促進(jìn)細(xì)胞成骨作用。掃描電鏡觀察細(xì)胞與材料接觸緊密,細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形伸展,分布均勻。結(jié)論：β-TCP支架具有良好的生物相容性,rADSCs在支架上共培養(yǎng)時(shí)支架材料不具有細(xì)胞毒性;rADSCs在β-TCP支架上共培養(yǎng)后,細(xì)胞的增殖能力無(wú)明顯減弱,并且仍具有向成骨分化的能力。第三部分應(yīng)用rADSCs/β-TCP骨組織工程復(fù)合體修復(fù)兔橈骨大段骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究目的：以β-TCP陶瓷為支架材料,復(fù)合兔脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞,探討構(gòu)建組織工程骨修復(fù)骨缺損的可行性。方法：體外培養(yǎng)的兔脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞(rADSCs)接種于β-TCP支架上,構(gòu)建rADSCs/β-TCP骨組織工程復(fù)合體,并進(jìn)行體外培養(yǎng)。制備兔橈骨2cm長(zhǎng)度的節(jié)段性骨缺損模型,分三組進(jìn)行骨缺損治療的研究：空白對(duì)照組(A組)不植入任何材料,單β-TCP人工骨對(duì)照組(B組),rADSCs/β-TCP復(fù)合體實(shí)驗(yàn)組(C組)。各組8只兔16例骨缺損。在手術(shù)后2周,4周,6周和8周時(shí)進(jìn)行X線檢查,按Lane-Sandhu X線評(píng)分法對(duì)骨愈合情況進(jìn)行比較,X線檢查后每組各選2只兔處死后取出標(biāo)本,對(duì)標(biāo)本進(jìn)行大體觀察以及進(jìn)行常規(guī)HE染色,光鏡下觀察骨修復(fù)情況,并觀察是否發(fā)生免疫排斥反應(yīng)。結(jié)果：通過(guò)Lane-SandhuX線評(píng)分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,C組比B組在各時(shí)間點(diǎn)評(píng)分均略高,但其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其兩組的評(píng)分均明顯高于A組,手術(shù)后8周結(jié)果示A組與其它兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組織學(xué)觀察C組在術(shù)后4周可觀察到骨缺損周?chē)_(kāi)始形成新生骨,并隨著時(shí)間的延長(zhǎng)新生骨量逐漸增多,在術(shù)后6周時(shí),材料逐漸降解,材料孔隙內(nèi)有新生骨長(zhǎng)入,在術(shù)后8周時(shí),材料降解明顯,材料孔隙基本消失,髓腔已基本再通。而至術(shù)后8周,2例B組及4例A組骨缺損未愈合,髓腔不通,與實(shí)驗(yàn)組有明顯差異。組織學(xué)檢測(cè)未見(jiàn)免疫排斥現(xiàn)象。結(jié)論：將同種異體脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞為種子細(xì)胞,接種于β-TCP支架材料構(gòu)建骨組織工程復(fù)合體,移植修復(fù)兔橈骨大段骨缺損部位。術(shù)后8周骨缺損部位完全修復(fù),髓腔再通及塑形基本完成。組織學(xué)檢測(cè)未見(jiàn)免疫排斥現(xiàn)象；ADSCs有望成為理想的修復(fù)骨缺損、促進(jìn)骨折愈合的組織工程骨所需要的種子細(xì)胞,為大段骨缺損組織工程的修復(fù)提供可行的技術(shù)方案,為臨床治療骨缺損提供新的方法。
【關(guān)鍵詞】：脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞 成脂分化 成骨分化 流式細(xì)胞儀 脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞 β-磷酸三鈣 骨組織工程 脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞 骨組織工程復(fù)合體 大段骨缺損 β-磷酸三鈣
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：Q813.11;R318.08
【目錄】：

• 英文縮略詞表4-5
• 中文摘要5-8
• Abstract8-13
• 前言13-15
• 第一部分 兔脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)、鑒定以及多向誘導(dǎo)分化研究15-30
• 1 實(shí)驗(yàn)材料15-16
• 2 實(shí)驗(yàn)方法16-21
• 3 結(jié)果21-27
• 4 討論27-29
• 5 小結(jié)29-30
• 第二部分 兔脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞在β-磷酸三鈣支架上體外共培養(yǎng),構(gòu)建rADSCs/β-TCP骨組織工程復(fù)合體及體外成骨分化的研究30-38
• 1 實(shí)驗(yàn)材料30-31
• 2 實(shí)驗(yàn)方法31-33
• 3 結(jié)果33-36
• 4 討論36-37
• 5 小結(jié)37-38
• 第三部分 應(yīng)用rADSCs/β-TCP骨組織工程復(fù)合體修復(fù)兔橈骨大段骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究38-54
• 1 實(shí)驗(yàn)材料38-39
• 2 實(shí)驗(yàn)方法39-42
• 3 結(jié)果42-51
• 4 討論51-52
• 5 小結(jié)52-54
• 參考文獻(xiàn)54-56
• 綜述56-61
• 參考文獻(xiàn)59-61
• 致謝61-62

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 畢曉娟;馬艷;江明;;大鼠腹股溝脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定及活體標(biāo)記[J];中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù);2011年14期

  本文關(guān)鍵詞：同種異體脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合β-磷酸三鈣支架修復(fù)兔橈骨大段骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：301280