納米DBM作為支架表面修飾材料及骨移植替代物的實驗研究

發(fā)布時間：2020-05-09 05:59

【摘要】：臨床上多種骨科疾患需要骨移植替代物行植骨融合和骨結(jié)構(gòu)修復重建,如創(chuàng)傷、腫瘤、骨折不愈合、骨組織發(fā)育不良、脊柱融合手術(shù)等等。骨結(jié)構(gòu)修復重建是改善骨缺損患者日常生活質(zhì)量、使其重新投入社會勞動的唯一有效方法,因此骨替代物的研究對社會發(fā)展具有極其重要的意義,也是骨組織工程的終極目標。目前已有數(shù)十種復合骨移植替代產(chǎn)品獲美國FDA批準用于臨床治療,這些產(chǎn)品雖然具有良好的生物相容性,能一定程度上誘導成骨分化,但難以同時滿足與宿主骨組織相匹配的機械性能和供成骨細胞滲透生長的合理三維孔隙結(jié)構(gòu),尤其在治療大段骨缺損時,現(xiàn)有的骨移植替代物產(chǎn)品難以達到臨床骨組織重建要求。鑒于天然骨組織特殊的生理微觀結(jié)構(gòu),理想的骨替代產(chǎn)品應具備以下條件:(1)與宿主骨組織相匹配的機械強度;(2)恰當?shù)目紫堵屎涂紫督Y(jié)構(gòu);(3)利于細胞粘附、分化和增殖的表面結(jié)構(gòu);(4)良好的生物相容性以及與骨組織生長相適應的可控降解率。由此可見,當前的眾多產(chǎn)品還遠遠達不到理想骨替代物的標準。如何改進骨替代原材料模擬構(gòu)建骨組織結(jié)構(gòu)技術(shù),顯得尤為重要。近年來,3D打印技術(shù)用于骨缺損的修復重建已成為一種新的熱點及趨勢,但單純的3D打印支架成骨誘導和骨傳導性能均欠佳,支架表面需要用一些具有骨誘導或成骨作用生物活性材料做修飾,才能改善其性能。目前用于表面修飾的材料主要是生物活性玻璃,生物陶瓷及納米羥基磷灰石等,但上述材料成分均為無機物,且成骨誘導性能較差,表面修飾物中骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)雖然能改善支架成骨誘導功能,但其確實效果有待進一步實驗考證。脫鈣骨基質(zhì)(DBM)主要由93%的膠原(傳導成骨表面活性物質(zhì))、5%的可溶性蛋白(誘導成骨的骨形態(tài)發(fā)生蛋白和轉(zhuǎn)化生長因子、胰島素樣生長因子等協(xié)同蛋白)以及2%的殘余礦化基質(zhì),是具有良好的誘導成骨、傳導成骨特性的商業(yè)化生物材料。它以單獨或聯(lián)合其他材料的方式廣泛用于骨折、骨不連、骨腫瘤、骨融合、股骨頭壞死等手術(shù)。但是DBM缺少骨礦物質(zhì),因機械強度較差而難以成為理想的骨移植替代物。但若將DBM經(jīng)過一定的物理方法進行顆粒尺度上的改變,而后作為3D打印支架的表面修飾,這有可能使支架在獲得穩(wěn)定機械強度的同時,增加支架的骨誘導性和骨傳導能力。將材料納米化并應用于骨缺損的修復成為近年來骨組織工程的研究熱點。其研究方向主要集中于礦化機理、改善支架骨誘導性能、組織修復、藥物載體、細胞載體及基因載體等醫(yī)學領域的應用,國內(nèi)外學者在這一領域已取得了良好的進展。但眾多骨移植材料中鮮有關于納米同種(異體)脫鈣骨基質(zhì)(nDBM)的研究報道。納米材料具有特殊的比表面積效應,它極易與外來原子吸附鍵結(jié)合,表現(xiàn)的特性不同于它在整體狀態(tài)時的性質(zhì)。研究表明,骨髓間充質(zhì)干細胞及成骨細胞對納米尺度材料極其敏感,在60-150nm時尤為明顯,納米顆粒及粗糙的納米凹槽結(jié)構(gòu)可有效增加絲狀偽足的感知能力,促進細胞擴散及粘附,使其在納米纖維構(gòu)成的三維微環(huán)境快速增殖。為此,本課首先通過改良Urist法制備凍干脫鈣骨基質(zhì),運用二次低溫物理研磨法將DBM研磨至納米級別,電鏡檢測其粒徑尺度并對其生物安全性進行系統(tǒng)評價。隨后將實驗組前期制備的PCL-TCP 3D打印支架進行nDBM表面修飾,并通過體外細胞實驗及動物骨缺損模型填充等實驗,對其生物相容性及體內(nèi)骨缺損修復效果進行評估。通過以上努力,發(fā)展具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的高生物安全性骨修復用生物材料的制備新方法,并為該種新型骨組織工程支架的進一步的應用提供科學依據(jù)。實驗第一部分:nDBM的制備及性能檢測目的:旨在通過物理研磨法將塊狀DBM處理至納米級,并對研磨效果及材料的生物安全性進行檢測方法:采用低溫研磨法,先將DBM初步研磨至微米級別顆粒,再通過高能球磨機進行納米尺度研磨,掃描電鏡觀測研磨效果及材料形貌。而后按醫(yī)用生物植入材料安全標準ISO10993(GB/T16886)對nDBM行急性毒性實驗、溶血實驗、致敏試驗及細胞毒性試驗,評價材料的生物安全性。結(jié)果:經(jīng)二次低溫物理研磨后,所制得的nDBM底層致密,呈纖維狀相互連接,纖維粗細不等,直徑約40-80nm,表面充滿不規(guī)則納米顆粒,顆粒直徑20nm-50nm左右,納米顆粒相互團聚,表面密布納米級別凹槽,納米纖維結(jié)構(gòu)間相互連接,內(nèi)部形成大量相互連通的微米級別孔隙,其微觀結(jié)構(gòu)符合納米生物材料范疇。實驗結(jié)果證明,nDBM不引起實驗動物急性毒性反應,溶血率復合生物材料安全性要求,無致敏現(xiàn)象發(fā)生,細胞毒性實驗顯示細胞增殖良好。因此,nDBM具有良好的生物相容性,可用于體內(nèi)植入實驗。結(jié)論:低溫物理研磨法能成功將DBM納米化,材料的生物安全性指標符合醫(yī)用植入材料安全標準。實驗第二部分:nDBM/PCL-TCP復合支架的構(gòu)建及生物學性能檢測目的:將nDBM修飾于PCL-TCP 3D打印支架表面,并對各組材料的生物相容性及成骨誘導性進行檢測。方法:采用浸泡凍干法將nDBM均勻負載于支架表面,通過掃描電鏡觀察復合支架構(gòu)建效果,而后進行體外細胞學實驗,CCK-8法檢驗骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖情況,實時熒光PCR、Westen bolt檢測材料成骨誘導相關基因及蛋白的表達,并對統(tǒng)計結(jié)果進行分析。結(jié)果:采用75%的乙醇作為溶劑,按nDBM與稀釋劑1:5的比例浸泡后的支架,經(jīng)凍干后,可使支架各纖維表面均勻覆蓋nDBM顆粒,電鏡掃描觀察發(fā)現(xiàn),nDBM與支架粘附良好,底層致密,表面布滿大小不一的nDBM顆粒,納米顆粒部分團聚,表面布滿納米級別凹槽,成功構(gòu)建了一種新型的nDBM/PCL-TCP復合支架。通過CCK-8檢測BMSCs的增殖情況,通過繪制細胞生長曲線,發(fā)現(xiàn)細胞在nDBM修飾的支架表面不斷增殖,各時間點細胞增長數(shù)量均高于單純PCL-TPC支架。Western blot、real-time PCR等多種實驗表明nDBM修飾的復合支架各成骨相關基因及蛋白表達水平明顯高于單純支架組。結(jié)論:采用凍干法能成功制備具有納米級別表面結(jié)構(gòu)的nDBM/PCL-TCP復合支架。CCK-8、Western blot、real-time PCR等多種實驗表明nDBM修飾的復合支架有利于BMSCs增殖并向成骨細胞方向分化。實驗第三部分:nDBM對兔股骨和nDBM/PCL-TCP復合支架對兔橈骨大段骨缺損修復的實驗研究目的:評價nDBM對兔股骨缺損及nDBM/PCL-TCP復合支架對兔橈骨大段骨缺損的修復能力。方法:建立兔股骨缺損模型,將nDBM填充入缺損部位并設立空白對照組;建立兔橈骨大段骨缺損模型,將nDBM/PCL-TCP復合支架植入缺損部位,對照組植入單純PCL-TCP支架。術(shù)后一定的時間點處死動物取材,通過大體觀察,Micro CT及組織切片染色等評價材料骨缺損修復情況。結(jié)果:大體觀察見nDBM填充組骨缺損區(qū)皮質(zhì)已基本愈合;nDBM/PCL-TCP復合支架組骨缺損兩端已有骨痂形成。影像學檢查提示nDBM組骨修復效果優(yōu)于空白組;nDBM/PCL-TCP復合支架組骨痂明顯生成,部分支架纖維表面甚至已形成骨橋,優(yōu)于單純PCL-TCP支架。組織切片染色顯示nDBM修飾的復合支架孔隙內(nèi)大量骨細胞長入、纖維形成,部分支架表面甚至形成板層骨,骨誘導及成骨性能均優(yōu)于單純PCL-TCP支架組。結(jié)論:nDBM/PCL-TCP復合支架能有效促進大段骨缺損區(qū)域骨再生與骨重建,PCL-TCP支架經(jīng)nDBM修飾后,骨誘導與骨傳導性明顯增強,有利于新生骨向支架內(nèi)長入。
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