【摘要】：[背景和目的] 隨著生物材料被廣泛應(yīng)用于臨床,生物材料植入感染(implant-associated infection)已經(jīng)成為令人棘手的常見(jiàn)醫(yī)院內(nèi)感染,有報(bào)道占醫(yī)院內(nèi)感染的50%,往往給患者帶來(lái)災(zāi)難性后果。大腸桿菌是臨床生物材料植入感染優(yōu)勢(shì)菌種,在心臟瓣膜置換術(shù)、關(guān)節(jié)置換術(shù)、腦室腹腔分流術(shù)等術(shù)后生物材料植入感染中大腸桿菌檢出率為3～10%。 大腸桿菌(Escherichia coli)是人體腸道中的條件致病菌,心臟大血管手術(shù)體外循環(huán)期間、神經(jīng)外科或骨科等手術(shù)控制性降壓期間、以及臨床上常見(jiàn)的失血性休克,均可導(dǎo)致腸通透性升高及腸道細(xì)菌移位,造成菌血癥,血液中的細(xì)菌為細(xì)菌在生物材料表面黏附提供菌源。細(xì)菌在生物材料表面一旦形成細(xì)菌生物膜,就能有效地抵御機(jī)體的防御反應(yīng)和抗生素的治療,是導(dǎo)致生物材料植入感染難以控制的根源。密度感應(yīng)系統(tǒng)(quorum sensing system)在細(xì)菌生物膜形成過(guò)程中起重要作用。Sperandio等研究表明大腸桿菌密度感應(yīng)調(diào)節(jié)子C (Quorum sensing E. coli regulator C, QseC)可以識(shí)別自誘導(dǎo)物3(AI-3)、腎上腺素(EPI)及去甲腎上腺素(NE)等信號(hào)分子,在浮游狀態(tài)時(shí)細(xì)菌的密度感應(yīng)系統(tǒng)中起重要調(diào)節(jié)作用。然而,在腸道大腸桿菌移位引發(fā)的生物材料植入感染中,大腸桿菌QseC的作用如何,目前相關(guān)報(bào)道甚少。 本研究采用Red同源重組技術(shù)構(gòu)建大腸桿菌K-12菌株qseC陰性突變菌株；在前期建立的聚氯乙烯材料表面細(xì)菌生物膜模型基礎(chǔ)上,采用激光掃描等技術(shù),探討大腸桿菌QseC對(duì)生物材料表面細(xì)菌生物膜形成能力的影響；通過(guò)失血性休克建立腸道細(xì)菌移位動(dòng)物模型,探討大腸桿菌QseC在腸道細(xì)菌移位引發(fā)生物材料植入感染中的作用；揭示防治大腸桿菌引發(fā)的生物材料植入感染的有效分子藥物靶標(biāo),為防治生物材料植入感染提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 [方法] 本研究分四部分： 1、應(yīng)用Red同源重組技術(shù)構(gòu)建大腸桿菌qseC陰性突變菌株：選用大腸桿菌K-12MC1000菌株為研究對(duì)象,應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增兩翼與目的基因上下游同源、含有氯霉素抗性基因片段,電擊轉(zhuǎn)化入大腸桿菌MC1000。在阿拉伯糖誘導(dǎo)下,含有質(zhì)粒pKD46的菌株MC1000表達(dá)Red同源重組酶,利用含同源臂的氯霉素抗性片段置換目的基因qseC,并進(jìn)一步利用FLP位點(diǎn)專(zhuān)一性重組將氯霉素抗性基因刪除。最后用鑒定引物行PCR對(duì)大腸桿菌qseC陰性突變菌株進(jìn)行鑒定。所得突變菌株標(biāo)記為qseC 2、大腸桿菌QseC在細(xì)菌生物學(xué)表型變化中的作用：測(cè)定大腸桿菌MC1000和MC1000ΔqseC的生長(zhǎng)曲線(xiàn),及其在泳動(dòng)能力檢測(cè)培養(yǎng)基上的運(yùn)動(dòng)能力。探討大腸桿菌QseC在細(xì)菌生物學(xué)表型變化中的作用。 3、大腸桿菌QseC在生物材料表面細(xì)菌生物膜形成中的作用：以?xún)芍甏竽c桿菌(MC1000菌株和MC1000ΔqseC菌株)為實(shí)驗(yàn)菌株,在培養(yǎng)基中添加EPI或NE,建立PVC材料表面細(xì)菌生物膜體外模型。實(shí)驗(yàn)中同時(shí)設(shè)置未經(jīng)EPI或NE處理的野生菌株和陰性突變菌株作為對(duì)照。采用半定量檢測(cè)方法測(cè)定大腸桿菌的細(xì)菌生物膜形成能力,應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡(CLSM)動(dòng)態(tài)觀(guān)察PVC材料表面大腸桿菌生物膜的形成過(guò)程、細(xì)菌群落數(shù)量及細(xì)菌生物膜厚度等,應(yīng)用掃描電鏡(SEM)觀(guān)察PVC材料表面大腸桿菌細(xì)菌生物膜的表面結(jié)構(gòu)。探討大腸桿菌QseC在PVC材料表面細(xì)菌生物膜形成中的作用。 4、QseC在腸道細(xì)菌移位并在生物材料表面細(xì)菌生物膜形成中的作用：SPF級(jí)健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為6組：空白+假休克組(空白-Sham),空白+休克組(空白-HS),MC1000+假休克組(M-Sham), MC1000ΔqseC+假休克組(Δ-Sham),MC1000+休克組(M-HS),MC1000ΔqseC+休克組(Δ-HS),每組6只。將實(shí)驗(yàn)菌株定植于大鼠腸道內(nèi),經(jīng)右下腹斜切口將PVC材料放入腹膜腔并建立失血性休克動(dòng)物模型。在休克后24h處死大鼠,嚴(yán)格無(wú)菌條件下取門(mén)靜脈血和腸系膜淋巴結(jié)、肝脾標(biāo)本行細(xì)菌培養(yǎng),采用平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)細(xì)菌移位率及菌落數(shù),并根據(jù)組織重量換算為每克組織的菌落總數(shù)(CFU/g);通過(guò)PCR反應(yīng)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒定,證實(shí)細(xì)菌來(lái)自于大鼠腸道內(nèi)的實(shí)驗(yàn)菌株；取出PVC材料片作細(xì)菌培養(yǎng)和鑒定,同時(shí)用SEM對(duì)材料表面細(xì)菌生物膜的形成情況進(jìn)行觀(guān)察。 [結(jié)果] 1、大腸桿菌qseC陰性突變菌株的構(gòu)建：PCR及DNA測(cè)序結(jié)果表明,qseC基因內(nèi)部序列已被刪除,且無(wú)氯霉素抗性基因,qseC基因已被成功敲除。 2、大腸桿菌QseC在細(xì)菌生物學(xué)表型變化中的作用：①M(fèi)C1000和MC1000ΔqseC在LB培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)并無(wú)明顯差異；②MC1000和MC1000ΔqseC在LBEPI(或LBNE)培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)并無(wú)明顯差異；③相對(duì)于MC1000菌株,MC1000ΔqseC突變株的運(yùn)動(dòng)能力明顯下降(P0.05)；④MC1000菌株在LBEPI和LBNE培養(yǎng)基中的運(yùn)動(dòng)力較之在LB培養(yǎng)基中明顯增強(qiáng)(P0.05),而當(dāng)存在EPI或NE時(shí)MC1000ΔqseC突變株的變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 3、大腸桿菌QseC在生物材料表面細(xì)菌生物膜形成中的作用：①PVC材料表面大腸桿菌生物膜的形成過(guò)程：PVC材料表面細(xì)菌群落數(shù)量及細(xì)菌生物膜厚度隨時(shí)間的變化而變化,培育18-24h時(shí)細(xì)菌群落數(shù)量達(dá)到高峰,培育24h“時(shí)細(xì)菌生物膜厚度達(dá)到峰值；②QseC在PVC材料表面細(xì)菌生物膜形成中的作用：與MC1000組相比,MC1000ΔqseC組PVC材料表面大腸桿菌生物膜的形成能力明顯降低(P0.05),單位面積細(xì)菌群落數(shù)量減少(P0.05),細(xì)菌生物膜厚度明顯減小(P0.05)；③EPI(或NE)對(duì)PVC材料表面大腸桿菌細(xì)菌生物膜形成的影響：添加EPI或NE后PVC材料表面MC1000細(xì)菌生物膜的形成能力明顯增強(qiáng)(P0.05),而添加EPI或NE后PVC材料表面MC1000ΔqseC細(xì)菌生物膜的形成能力并無(wú)明顯改變(P0.05)。 4、QseC在腸道細(xì)菌移位并在生物材料表面細(xì)菌生物膜形成中的作用：①在大鼠門(mén)靜脈血、腸系膜淋巴結(jié)、肝脾組織內(nèi)以及PVC材料片上,均分離出耐鏈霉素細(xì)菌,經(jīng)PCR證實(shí)這些細(xì)菌就是來(lái)自于灌飼到大鼠腸道的實(shí)驗(yàn)菌株；②Δ-HS組大鼠細(xì)菌移位率和內(nèi)臟組織細(xì)菌含量都比M-HS組明顯降低(P0.05);③Δ-HS組大鼠PVC材料上的細(xì)菌含量較之M-HS組有明顯降低(P0.05)。 [結(jié)論] 1、大腸桿菌QseC缺失后運(yùn)動(dòng)能力顯著下降。兒茶酚胺對(duì)大腸桿菌運(yùn)動(dòng)能力有直接促進(jìn)作用,而且該作用是通過(guò)QseC介導(dǎo)的。 2、生物材料表面大腸桿菌生物膜的形成是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程,生物材料表面細(xì)菌群落數(shù)量及細(xì)菌生物膜厚度的增加與時(shí)間的變化相關(guān),這可能與生物材料植入感染的臨床感染特征有關(guān)。 3、大腸桿菌QseC在生物材料表面細(xì)菌生物膜的形成中具有重要作用。兒茶酚胺對(duì)大腸桿菌在生物材料表面細(xì)菌生物被膜的形成有直接促進(jìn)作用,而且該作用是通過(guò)QseC介導(dǎo)的。 4、大腸桿菌QseC缺失后,運(yùn)動(dòng)能力降低,同時(shí)QseC信號(hào)鏈中斷,細(xì)菌對(duì)腸粘膜的侵襲力和穿透力減弱,導(dǎo)致細(xì)菌移位發(fā)生率下降。QseC-1腎上腺素信號(hào)通路在腸道大腸桿菌移位并在生物材料表面定植中起重要作用。
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R639;R318.08

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2559176