【摘要】：第一部分新型醫(yī)用可吸收鎂合金JDBM的生物毒性 目的：交大鎂合金系列（Jiao Da bio-magnesium series, JDBM）是上海交通大學(xué)輕合金精密成型國(guó)家工程研究中心設(shè)計(jì)開發(fā)的生物相容性好、強(qiáng)度和塑韌性相匹配、腐蝕行為近乎均勻的新型高性能生物醫(yī)用Mg-Nd-Zn-Zr (平衡-3-0.2-0.4wt.%)基合金系列，分為2類，JDBM1具有高強(qiáng)度和中等塑性，應(yīng)用于骨科；JDBM2具有高塑性和中等強(qiáng)度，應(yīng)用于血管支架。該合金體系添加了少量細(xì)胞毒性輕微的輕稀土元素Nd作為低合金化元素，Nd的加入可以保證鎂合金具有良好的時(shí)效析出強(qiáng)化和固溶強(qiáng)化效果，并可大幅度提高合金基體的電極電位，減小基體與第二相的電偶腐蝕電位差，從而提高鎂合金的耐均勻腐蝕性能。Zn是人體生理需要的微量元素，微量加入可提高合金強(qiáng)度及塑性加工能力；微量Zr作為晶粒細(xì)化劑可提高合金的強(qiáng)韌性和耐蝕性，其在鎂合金中的生物相容性已經(jīng)證實(shí)。JDBM的強(qiáng)度、柔韌性、耐蝕性能和生物相容性全面超越已經(jīng)在歐洲進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)的WE43鎂合金。相比于商業(yè)性的WE43和AZ31鎂合金，JDBM具有更好的生物相容性。JDBM在體內(nèi)90天時(shí)基本完好，在180天時(shí)降解少于40%。本實(shí)驗(yàn)的目的，即通過研究含輕稀土Nd元素的JDBM鎂合金及單純的Nd對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠胚胎成骨細(xì)胞株MC3T3-E1的毒性，分析JDBM鎂合金中稀土元素Nd的體外成骨細(xì)胞毒性，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分通過研究Nd對(duì)昆明小鼠骨及周圍組織的生理病理影響，以及其在小鼠各器官組織中的分布，來研究Nd的生物安全性及其動(dòng)物體內(nèi)分布情況。 方法：按標(biāo)準(zhǔn)方法用aMEM培養(yǎng)基制作Nd的浸提液，并稀釋為1/2、1/4、1/8幾個(gè)不同的濃度梯度，同時(shí)制作Ti合金、WE43鎂合金、JDBM鎂合金及CaP涂層JDBM鎂合金的浸提液，以正常培養(yǎng)組做空白對(duì)照，以Ti合金浸提液組做陰性對(duì)照，以0.64%苯酚組做陽(yáng)性對(duì)照，用含10%澳洲胎牛血清的aMEM培養(yǎng)基對(duì)MC3T3-E1成骨細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，觀察其不同時(shí)間的形態(tài)變化及增殖情況，并以CCK8法檢測(cè)其不同時(shí)間的細(xì)胞增殖活性，以Annexin V PI雙染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同時(shí)間的細(xì)胞凋亡情況。將梯度量的Nd微粒加入正常培養(yǎng)的成骨細(xì)胞培養(yǎng)液中，最低量接近JDBM植入物釋放的Nd量，觀察微粒入胞情況，并制作細(xì)胞爬片，用電子目鏡接普通顯微鏡直接動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞吞噬Nd微粒的情況，然后行HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)變化。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分，將不同量的Nd微粒置于小鼠股骨旁組織，檢測(cè)1、3、5天小鼠的血液電解質(zhì)、肝腎功能變化、Nd在小鼠體內(nèi)的分布及局部病理切片觀察Nd微粒引起的病理變化。 結(jié)果：用CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，Nd浸提液原液組細(xì)胞毒性較大，與苯酚陽(yáng)性對(duì)照組實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，其與正常對(duì)照組、Ti合金浸提液組、JDBM浸提液組、WE43浸提液組、Nd浸提液1/4、1/8濃度組相比P 0.00001，而后幾者之間無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Nd浸提液原液及苯酚組與Nd浸提液稀釋至1/2組之間P 0.01，有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。從流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果得知，隨Nd浸提液濃度及作用時(shí)間的增加，成骨細(xì)胞凋亡明顯增多。微粒入胞實(shí)驗(yàn)動(dòng)態(tài)及靜態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，成骨細(xì)胞通過主動(dòng)胞吞作用吞噬周圍環(huán)境中的Nd微粒，微粒較少時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)明顯影響，微粒量多時(shí)則可導(dǎo)致成骨細(xì)胞膜破裂，直至細(xì)胞崩解死亡。通過計(jì)算比較，JDBM及WE43中Nd2.5%左右的含量可能會(huì)導(dǎo)致周圍細(xì)胞的損傷。將不同量的Nd微粒置于小鼠股骨旁組織，小鼠的血液電解質(zhì)及肝腎功能較正常組無(wú)明顯變化。小鼠體內(nèi)各組織器官的Nd元素分布因無(wú)合適的檢測(cè)合作單位而待測(cè)，病理組織切片顯示大量的Nd微粒對(duì)周圍組織細(xì)胞有一定的損傷。 結(jié)論： Nd浸提液的成骨細(xì)胞毒性及對(duì)成骨細(xì)胞凋亡的影響隨濃度的減小而減小，JDBM中微量Nd對(duì)成骨細(xì)胞無(wú)明顯毒性；成骨細(xì)胞通過主動(dòng)胞吞作用攝取周圍環(huán)境中的Nd微粒，當(dāng)微粒數(shù)量達(dá)到一定程度時(shí)，成骨細(xì)胞崩解，JDBM中微量Nd顆粒對(duì)成骨細(xì)胞的增殖及形態(tài)無(wú)明顯不良影響。相對(duì)于Nd微粒的細(xì)胞損傷，JDBM和WE43中的Nd含量可能過高。Nd微粒對(duì)小鼠的肝腎功能、電解質(zhì)無(wú)明顯影響，多量的Nd微粒對(duì)周圍組織細(xì)胞有一定的損傷。 第二部分新型醫(yī)用可吸收鎂合金JDBM的髓內(nèi)降解及病理生理效應(yīng) 目的：生物體內(nèi)可降解吸收材料是生物材料發(fā)展的重要方向，由于金屬材料具有較好的強(qiáng)度和塑韌性，因此金屬基可降解吸收材料具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。鎂是所有金屬材料中生物力學(xué)性能與人體骨最接近的金屬材料，具有理想的生物力學(xué)相容性，因此，鎂合金作為可降解生物材料具有巨大的應(yīng)用潛力。目前臨床應(yīng)用的生物體內(nèi)可降解吸收材料主要是聚合物和某些陶瓷材料，如聚乳酸、磷酸鈣等。但由于聚合物材料強(qiáng)度偏低、陶瓷材料的塑韌性較差限制了其廣泛使用。近年來，以生物可降解鎂合金(biodegradablemagnesium alloys)為主要代表的具有生物可降解(吸收)特性的新一代醫(yī)用金屬材料的研究受到了人們的特別關(guān)注。鎂合金因具有與人體骨頭接近的密度和彈性模量、高比強(qiáng)度和比剛度、生物可降解性以及生物相容性等優(yōu)點(diǎn)，近10年來國(guó)內(nèi)外研究人員對(duì)其應(yīng)用于骨內(nèi)植物、骨組織工程支架和心血管支架等領(lǐng)域進(jìn)行了廣泛的研究。然而，目前大多數(shù)研究均以現(xiàn)有商用鎂合金為對(duì)象，如含Al元素的AZ31、AZ91以及含重稀土元素的WE43等，并未考慮到作為生物材料的安全性等問題。上海交通大學(xué)輕合金精密成型國(guó)家工程研究中心，作為我國(guó)重要的鎂合金材料及精密成型工藝研究的國(guó)家級(jí)研究基地，近年來在可降解醫(yī)用鎂合金材料研究領(lǐng)域也取得了令國(guó)際同行矚目的研究成果。該研究中心研究人員與醫(yī)學(xué)研究人員合作，積極開展生物醫(yī)用鎂合金材料的臨床應(yīng)用基礎(chǔ)研究。上海交通大學(xué)研究人員運(yùn)用第一性原理計(jì)算與分子動(dòng)力學(xué)模擬方法，并與實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，從原子、分子水平深入系統(tǒng)地探索了鎂的變形機(jī)制，定量評(píng)估了所優(yōu)選的生物相容性好的合金元素對(duì)鎂中層錯(cuò)能及位錯(cuò)滑移、孿生等變形傾向的影響，設(shè)計(jì)開發(fā)了生物相容性好、強(qiáng)度和塑韌性相匹配、腐蝕行為接近均勻腐蝕的新型高性能生物醫(yī)用鎂合金Mg-Nd-Zn-Zr基合金系列(Jiao Dabio-magnesium series，簡(jiǎn)稱JDBM)，已經(jīng)分別申請(qǐng)中國(guó)和國(guó)際專利保護(hù)。該合金體系中通過加入少量細(xì)胞毒性輕微(臨床可接受)的輕稀土元素Nd作為低合金化元素，Nd的加入可以保證鎂合金具有良好的時(shí)效析出強(qiáng)化和固溶強(qiáng)化效果，并可大幅度提高鎂合金基體的電極電位，減小基體與第二相的電偶腐蝕電位差，從而提高鎂合金的耐均勻腐蝕性能。JDBM可降解鎂合金自研制成功以來，一直在進(jìn)行各項(xiàng)臨床前實(shí)驗(yàn)研究，以了解其各項(xiàng)生物學(xué)性能，以便進(jìn)一步改進(jìn)其各項(xiàng)性能并爭(zhēng)取早日應(yīng)用于臨床醫(yī)療實(shí)踐中。我們已經(jīng)做了一些JDBM鎂合金釘板系統(tǒng)方面的研究，取得了許多重要的第一手資料，但尚未進(jìn)行JDBM鎂合金髓內(nèi)針方面的實(shí)驗(yàn)研究。本實(shí)驗(yàn)的目的在于檢測(cè)可降解JDBM鎂合金髓內(nèi)針對(duì)大鼠股骨代謝的影響及其病理生理變化，并檢測(cè)JDBM鎂合金髓內(nèi)針在大鼠股骨髓腔內(nèi)的降解行為，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究對(duì)本材料的醫(yī)用價(jià)值做出一定程度的評(píng)估。 方法：將JDBM鎂合金及對(duì)照的Ti合金、WE43鎂合金、CaP涂層JDBM做成1mm x30mm的髓內(nèi)針，消毒后進(jìn)行無(wú)菌手術(shù)將其植入雄性SD大鼠左側(cè)股骨髓腔內(nèi)，每組6只。在1、3個(gè)月進(jìn)行99mTc-MDP骨三相掃描及SPECT-CT檢查，通過骨顯像核素掃描了解大鼠股骨植入JDBM鎂合金髓內(nèi)針后的代謝狀況，比較與對(duì)照側(cè)及對(duì)照組的差異。1、3個(gè)月拍攝X線片了解髓內(nèi)針的位置與降解的大體情況。在15天，1、3、6個(gè)月檢測(cè)大鼠的血生化電解質(zhì)變化。3、6個(gè)月做骨組織病理硬切片，通過骨硬組織切片觀察大鼠股骨的病理變化，并檢測(cè)不同時(shí)間髓內(nèi)針的降解情況，確定其降解速率。 結(jié)果：JDBM髓內(nèi)針組大鼠股骨的放射性標(biāo)記物攝取率明顯高于對(duì)側(cè)股骨及Ti合金對(duì)照組，P0.01，與WE43組及CaP涂層JDBM組相比無(wú)明顯差異。骨三相掃描顯示鎂合金髓內(nèi)針植入側(cè)血供旺盛。血電解質(zhì)檢測(cè)各組未見明顯差異。大鼠股骨X線片攝片顯示，1、3月時(shí)JDBM髓內(nèi)針形態(tài)完好，密度均勻，但6、8月時(shí)影像略顯模糊，X線透光程度不等，CaP涂層JDBM髓內(nèi)針及WE43髓內(nèi)針也出現(xiàn)程度不等的類似變化，可能系鎂合金刺激周圍骨組織增生所致。大鼠骨硬組織病理切片顯示，JDBM髓內(nèi)針在大鼠髓腔內(nèi)緩慢降解，并促進(jìn)骨組織增生，未見明顯畸形細(xì)胞。與Ti合金組相比，JDBM及CaP涂層JDBM組、WE43組髓內(nèi)針周圍成骨明顯。1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月的時(shí)間內(nèi)，JDBM髓內(nèi)針在大鼠骨髓腔內(nèi)緩慢降解，至6個(gè)月時(shí)降解不超過20%，直徑由最初的1mm至大于0.8mm，質(zhì)量減少不超過20%，而CaP涂層JDBM組降解更為緩慢，WE43組降解略快于JDBM組，Ti合金組無(wú)降解。 結(jié)論： JDBM對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大鼠的血清肝腎功能、電解質(zhì)無(wú)明顯影響。JDBM在大鼠髓腔內(nèi)4個(gè)月時(shí)降解比較輕微，刺激周圍骨組織增生的作用已經(jīng)顯現(xiàn)，6個(gè)月時(shí)周圍骨組織明顯增生，相應(yīng)的JDBM髓內(nèi)針影像略顯模糊，應(yīng)力遮擋效應(yīng)減弱。JDBM等鎂合金髓內(nèi)針可導(dǎo)致大鼠局部核素?cái)z取增多，表明局部代謝旺盛，鎂合金有促進(jìn)大鼠髓腔內(nèi)代謝的作用。JDBM髓內(nèi)針可促進(jìn)骨代謝及骨形成，有利于損傷骨組織的修復(fù)。JDBM鎂合金髓內(nèi)針在骨髓腔內(nèi)逐漸降解，后期降解趨于緩慢。JDBM及CaP涂層JDBM、WE43髓內(nèi)針植入大鼠股骨后，其髓腔內(nèi)組織皆未發(fā)現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)。 第三部分新型醫(yī)用可吸收鎂合金JDBM與葡萄球菌粘附及生物膜模型 目的：骨科假體植入后葡萄球菌感染是世界范圍內(nèi)比較棘手的問題，醫(yī)療實(shí)踐中通過應(yīng)用各種材料改性技術(shù)和研發(fā)新材料等方法以期減少感染的發(fā)生。關(guān)節(jié)假體感染（prosthetic joint infection，PJI）和無(wú)菌性松動(dòng)是人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后的重要并發(fā)癥。在美國(guó)，PJI是導(dǎo)致人工全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)失敗的首要原因，也是人工全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)失敗的第三大原因。微生物生物膜（biofilm，BF）作為PJI的病原基礎(chǔ)，對(duì)感染的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸具有決定性作用。根據(jù)臨床統(tǒng)計(jì)，導(dǎo)致關(guān)節(jié)假體感染的主要致病菌為表皮葡萄球菌。金黃色葡萄球菌是創(chuàng)傷感染中最常見的病原前，而且可引致敗血癥、癤、膿腫等。作為人獸共患病的重要病原菌，其致病性長(zhǎng)期來為醫(yī)學(xué)家所關(guān)注。但往主要對(duì)凝固酶、葡澈酶等胞外酶及腸毒素、殺白細(xì)胞毒、表皮剝脫毒素及毒性休克綜合征毒素I等外毒素進(jìn)行了研究，而忽視了對(duì)其牯附機(jī)制的探討。眾所周知，粘附是細(xì)菌感染的先決條件，否則細(xì)菌就無(wú)法定居和繁殖，也不能產(chǎn)生和釋放胞外酶和外毒素=粘附雖非直接導(dǎo)致組織受損，但對(duì)組織的選擇和疾病的嚴(yán)重程度卻有重要的影響。因此，近年來在對(duì)金黃色葡萄球菌胞外產(chǎn)物研究日漸深入的研究，同時(shí)，對(duì)其粘附機(jī)制的研究亦獲長(zhǎng)足的進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌有數(shù)種粘附素。根據(jù)臨床統(tǒng)計(jì)，導(dǎo)致關(guān)節(jié)假體感染的主要致病菌為表皮葡萄球菌。表皮葡萄球菌存在于人體的體表，與其他正常菌群一道構(gòu)成人體皮膚粘膜等的微生態(tài)共同抵御外來微生物的侵襲。同時(shí)由于寄生部位改變，在凝固酶陰性葡萄球菌(Coagulase Negative Staphvlococcl；CoNS)引起醫(yī)院感染中最為常見。國(guó)外報(bào)道表葡占CoNS的57％和68％，特別是在病人體內(nèi)留置醫(yī)療器械引起的感染中表葡是最重要的病原之一，占39％。表皮葡萄球菌通過ica fIntercellular Adhesion)操縱子表達(dá)多聚糖胞間粘附因子(Polysaccharide Intercelluar Adhesion PIA)，使之粘附于器械靜脈導(dǎo)管、人造心瓣膜、人造關(guān)節(jié)、人造血管、心臟起搏器及隱形眼鏡等)表面，形成一層菌膜，以抵抗機(jī)體免疫系統(tǒng)和抗生素的攻擊，是表葡引起留置器械相關(guān)感染的重要環(huán)節(jié)。本院骨科假體感染分離出來的致病菌以表皮葡萄球菌為主。本實(shí)驗(yàn)的目的在于探索新型可降解材料JDBM鎂合金對(duì)于葡萄球菌的表面粘附及生長(zhǎng)增殖的影響，并制作JDBM鎂合金植入動(dòng)物體內(nèi)的感染模型，以研究新材料JDBM鎂合金的臨床適用性。 方法：將JDBM鎂合金、WE43鎂合金、Ti合金制成1mm x10mm的圓形薄片，進(jìn)行環(huán)氧乙烷消毒。細(xì)菌采用RP62A、ATCC12228等菌株，用細(xì)菌比濁儀，以TSB培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)菌濃度至約0.5麥?zhǔn)蠁挝唬ň考s1x108/ml），然后在4.5ml EP管（eppendorf管）中加入2ml調(diào)好的細(xì)菌，加入無(wú)菌合金圓片共培養(yǎng)1至3天，每種材料各做一個(gè)重復(fù)培養(yǎng)的EP管。吸去TSB培養(yǎng)基，用PBS沖洗金屬片3次，然后加入2ml PBS，放入超聲震蕩儀中，中等強(qiáng)度超聲能量分別震蕩5、10分鐘，將所得液體分別按102、104梯度用PBS稀釋，各取100ul稀釋后的PBS菌液并劃到血平板，培養(yǎng)24小時(shí)后作細(xì)菌計(jì)數(shù)，看各組間粘附的細(xì)菌量有無(wú)差異。實(shí)驗(yàn)檢測(cè)金屬片表面不同粗糙度對(duì)細(xì)菌粘附的影響。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分，將JDBM、WE43鎂合金及Ti合金做成3mm x10mm的螺釘，用環(huán)氧乙烷熏蒸法消毒，嚴(yán)格無(wú)菌操作下將實(shí)驗(yàn)螺釘植入普通級(jí)新西蘭大白兔左側(cè)股骨外上髁，手術(shù)傷口愈合后將菌株ST239、SF8300以PBS調(diào)至0.5麥?zhǔn)蠁挝�，并將�?xì)菌濃度稀釋至1x105/ml，分別注射各菌株0.5ml至實(shí)驗(yàn)兔的股骨旁組織靠近植入的螺釘，生理鹽水注射作為陰性對(duì)照，于注射細(xì)菌后第1、3周時(shí)拍攝實(shí)驗(yàn)兔的股骨X線片，并于第3周拍攝實(shí)驗(yàn)兔的股骨x線片后將其處死，做局部組織病理切片檢查，同時(shí)取局部分泌物涂片行姬姆薩染色，將細(xì)菌行血瓊脂平板培養(yǎng)一日后涂片檢查，最后進(jìn)行細(xì)菌類別鑒定。 結(jié)果：開始所用的JDBM、WE43、Ti合金組材料光滑度相同，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RP62A及ATCC12228的細(xì)菌粘附并無(wú)明顯差別，其血瓊脂培養(yǎng)板的細(xì)菌計(jì)數(shù)在一個(gè)數(shù)量級(jí)，而改變金屬圓片的表面光滑度后，再次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)粗糙度大的金屬片表面粘附了更多的細(xì)菌，其粘附細(xì)菌量的多少與粗糙度成正相關(guān)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分，細(xì)菌ST239注入兔股骨植入物旁，第1周和第三周時(shí)均可見發(fā)生嚴(yán)重的局部反應(yīng)，有大量的乳白色乳酪樣物質(zhì)產(chǎn)生，SF8300注射后局部有少量乳白色乳酪樣物質(zhì)產(chǎn)生，直接涂片瑞氏染色及血瓊脂平板培養(yǎng)后涂片瑞氏染色檢查，皆發(fā)現(xiàn)大量細(xì)菌存在，經(jīng)鑒定，確定感染的細(xì)菌為實(shí)驗(yàn)所注射的細(xì)菌，而生理鹽水注射后局部無(wú)明顯化膿及分泌物產(chǎn)生。 結(jié)論： JDBM、WE43、Ti合金材料本身對(duì)于葡萄球菌的粘附量無(wú)明顯差異，但不同的材料表面粗糙度對(duì)于細(xì)菌的粘附有明顯影響，材料表面粗糙度越大，細(xì)菌粘附越多，材料表面越光滑，細(xì)菌粘附越少。我們通過在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物新西蘭大白兔的股骨植入物旁注射1x105濃度的細(xì)菌ST239很容易造成假體感染生物膜的動(dòng)物模型，注射SF8300可以造成輕度感染，而注射生理鹽水未造成明顯的局部感染及生物膜形成。有植入的假體存在的情況下，不同種類細(xì)菌對(duì)兔股骨旁組織的感染能力及假體成膜能力不同。 第四部分JDBM鎂合金、纖維蛋白原與葡萄球菌成骨細(xì)胞內(nèi)化作用 目的：在骨科感染中，多種致病葡萄球菌可以進(jìn)入成骨細(xì)胞，在其中生長(zhǎng)繁殖，產(chǎn)生毒素，破壞細(xì)胞，并造成細(xì)胞的損傷與崩解壞死，或長(zhǎng)期存活于細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致抗生素不能對(duì)其進(jìn)行殺傷。內(nèi)化是生物大分子(包括細(xì)菌、病毒等)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的膜泡轉(zhuǎn)運(yùn)過程。廣義地說,內(nèi)化是指活細(xì)胞在生活狀態(tài)下,自外環(huán)境中攝取物質(zhì)分子的一種模式。小分子物質(zhì)如水、氨基酸、單糖以及離子等,可借助細(xì)胞膜的通透性機(jī)制而直接進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。但生物大分子物質(zhì)(如細(xì)菌、病毒等)不能直接通透細(xì)胞膜,常常需先在細(xì)胞膜的某些區(qū)域產(chǎn)生凹陷,將其包裹于小的膜區(qū)域內(nèi),隨后凹陷進(jìn)一步向細(xì)胞質(zhì)內(nèi)延伸,并與細(xì)胞膜脫離,在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)形成獨(dú)立的膜性小泡,引發(fā)一系列相關(guān)界膜小泡的生成、融合、轉(zhuǎn)運(yùn)及分離,上述生物大分子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的膜泡轉(zhuǎn)運(yùn)全過程稱之為內(nèi)化,亦稱為內(nèi)吞作用(endocytosis)。其主要形式有吞噬作用(phagocytosis)、吞飲作用(pinocytosis)、受體介導(dǎo)的內(nèi)化(receptor-mediated internalization)、越胞作用(d-iacytosis)和穿細(xì)胞吞吐作用(transcytosis)等。它是當(dāng)今生命科學(xué)研究的重要課題之一。金黃色葡萄球菌（staphylococcus aureus, SA）能侵入成骨細(xì)胞內(nèi),其侵入能力與菌株本身特點(diǎn)有關(guān)。金黃色葡萄球菌侵入成骨細(xì)胞后能逃避慶大霉素的殺菌作用,這可能與臨床上骨髓炎不易為抗生素治愈有關(guān)。金黃色葡萄球菌是血源性骨髓炎及骨科植入物感染的主要來源，約有65%~70%的骨髓炎由金黃色葡萄球菌引起。有研究表明金黃色葡萄球菌能侵入某些體外培養(yǎng)的宿主細(xì)胞，如成纖維細(xì)胞、鼠的腎細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等。金黃色葡萄球菌的這種侵入真核細(xì)胞的能力可能與其引起骨髓炎的病理機(jī)制有關(guān)。表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis,SE)是一種革蘭染色陽(yáng)性、凝固酶陰性的葡萄球菌,一般粘附于人體的皮膚和黏膜,是重要的條件致病菌，近年來隨著留置靜脈導(dǎo)管，植入人工心瓣膜、人工晶體、人工假體等侵襲性操作的增加,表皮葡萄球菌的感染率不斷上升，并且由于抗生素的廣泛使用甚至濫用，導(dǎo)致表皮葡萄球菌耐藥菌株日益增多，出現(xiàn)了多重耐藥。表皮葡萄球菌在生物材料表面形成的生物膜是其致病的主要因素，生物膜的形成需要許多因子的參與，這些因子又受相關(guān)基因的調(diào)控。由于表皮葡萄球菌分泌的毒性因子較金黃色葡萄球菌少，導(dǎo)致其致病的主要因素是表皮葡萄球菌粘附于植入體內(nèi)的生物材料表面形成生物膜，它不僅使宿主體內(nèi)的免疫反應(yīng)呈抑制狀態(tài)，促使表皮葡萄球菌增殖，而且其黏液阻礙了親水性的抗生素進(jìn)入菌體發(fā)揮殺菌作用,使感染呈慢性、持續(xù)性和反復(fù)性的特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)的目的即在于研究不同的臨床株表皮葡萄球菌對(duì)成骨細(xì)胞的內(nèi)化作用的差異，并研究JDBM鎂合金及纖維蛋白原對(duì)實(shí)驗(yàn)細(xì)菌內(nèi)化作用的影響。 方法：將MC3T3-E1成骨細(xì)胞以每孔1ml含10%澳洲胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于24孔板，每孔細(xì)胞量5x104，連續(xù)兩天更換培養(yǎng)基，至細(xì)胞生長(zhǎng)至超過50%面積。以含胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基通過菌量比濁儀調(diào)整23株臨床株及標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照株細(xì)菌ATCC12593的細(xì)菌濃度調(diào)至0.5麥?zhǔn)蠁挝唬s1x108/ml。吸去培養(yǎng)孔內(nèi)的培養(yǎng)基，每孔分別加入1ml含實(shí)驗(yàn)細(xì)菌的培養(yǎng)基，置于37℃的二氧化碳孵箱孵育2小時(shí)，然后以PBS洗三次，每孔加入含90ug/ml的萬(wàn)古霉素的DMEM完全培養(yǎng)基1ml，置于二氧化碳孵箱37℃培養(yǎng)2小時(shí)，以PBS洗三次去掉細(xì)胞外被萬(wàn)古霉素殺死的細(xì)菌，加入0.1%曲拉通作用10min，使細(xì)胞崩以解釋放進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌，將所得液體用PBS按102、104濃度梯度稀釋后，以血瓊脂平板劃板，在35℃的條件下培養(yǎng)，次日觀察平板有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，對(duì)有細(xì)菌者比較數(shù)量級(jí)差異并計(jì)數(shù)。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次并比較結(jié)果異同。至于纖維蛋白原對(duì)細(xì)菌內(nèi)化的影響部分，將MG63骨肉瘤細(xì)胞用含10%澳洲胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于24孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至接近鋪滿底面積，把9株骨科臨床假體感染分離的致病菌及ATCC12228、ATCC12598、RP62A按1x108/ml細(xì)菌濃度，，每孔1ml細(xì)菌液接種的于各培養(yǎng)孔，每株細(xì)菌按是否加纖維蛋白原做2個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)3小時(shí)后，吸去培養(yǎng)液，每個(gè)培養(yǎng)孔中各加入1ml含100ug/ml萬(wàn)古霉素的完全培養(yǎng)液，37℃條件下在二氧化碳孵箱內(nèi)培養(yǎng)培養(yǎng)細(xì)胞并過夜。次日吸去各培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液，將各培養(yǎng)孔用PBS洗3遍，然后每孔加入PBS配制的0.1%曲拉通作用10min，以使細(xì)胞崩解，釋放出進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌，所得液體將原液及102稀釋液劃于血瓊脂培養(yǎng)板，在35℃的孵箱內(nèi)培養(yǎng)過夜，次日觀察有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，計(jì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)菌。纖維蛋白原和JDBM對(duì)細(xì)菌內(nèi)化的影響方案基本同前。纖維蛋白原對(duì)細(xì)菌內(nèi)化的影響部分，將MG63骨肉瘤細(xì)胞用含10%澳洲胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于24孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至接近鋪滿底面積，把9株骨科臨床假體感染分離的致病菌及ATCC12228、ATCC12598、RP62A按1x108/ml細(xì)菌濃度，每孔1ml細(xì)菌液接種的于各培養(yǎng)孔，每株細(xì)菌按是否加纖維蛋白原做2個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)3小時(shí)后，吸去培養(yǎng)液，每個(gè)培養(yǎng)孔中各加入1ml含100ug/ml萬(wàn)古霉素的完全培養(yǎng)液，37℃條件下在二氧化碳孵箱內(nèi)培養(yǎng)培養(yǎng)細(xì)胞并過夜。次日吸去各培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液，將各培養(yǎng)孔用PBS洗3遍，然后每孔加入PBS配制的0.1%曲拉通作用10min，以使細(xì)胞崩解，釋放出進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌，所得液體將原液連續(xù)10倍稀釋后劃于血瓊脂培養(yǎng)板，在37℃的孵箱內(nèi)培養(yǎng)過夜，次日觀察有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，計(jì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)菌。JDBM對(duì)細(xì)菌內(nèi)化的影響部分，類似于纖維蛋白原的研究方案，用含10%FBS的Ti合金、WE43、JDBM浸提液按上述方案替換培養(yǎng)液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，觀察骨科植入材料浸提液對(duì)臨床表皮葡萄球菌內(nèi)化的影響。 結(jié)果：各個(gè)臨床菌株對(duì)成骨細(xì)胞的內(nèi)化作用強(qiáng)弱不等，有的細(xì)菌對(duì)成骨細(xì)胞的內(nèi)化作用很強(qiáng)，有的菌株完全看不到對(duì)成骨細(xì)胞的內(nèi)化。金黃色葡萄球菌的內(nèi)化作用較強(qiáng)，毒力較大，鏡下觀察，成骨細(xì)胞中加入諸如ATCC12598等金黃色葡萄球菌0.5h，細(xì)胞內(nèi)即可見細(xì)菌進(jìn)入，作用時(shí)間稍長(zhǎng)則可見細(xì)胞破壞或崩解。一般情況下，內(nèi)化菌株加入成骨細(xì)胞培養(yǎng)孔中一定時(shí)間，加入萬(wàn)古霉素2h，然后停止萬(wàn)古霉素的作用，將干預(yù)后的細(xì)胞用PBS清洗3遍后，將清洗得到的液體劃到羊血瓊脂培養(yǎng)板上培養(yǎng)一日，有時(shí)會(huì)顯示少量細(xì)菌存在。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不管有無(wú)纖維蛋白原干預(yù)，細(xì)菌內(nèi)化的量沒有明顯的不同。JDBM、WE43以及Ti合金的浸提液，對(duì)于葡萄球菌內(nèi)化于成骨細(xì)胞沒有明顯的影響。 結(jié)論：一般金黃色葡萄球菌毒力比表皮葡萄球菌大，其侵襲力強(qiáng)，內(nèi)化實(shí)驗(yàn)中進(jìn)入成骨細(xì)胞內(nèi)部的菌量多，它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)多成團(tuán)生長(zhǎng)；而表皮葡萄球菌毒力弱，侵襲力弱，內(nèi)化作用也較弱，在細(xì)胞內(nèi)呈散在分布。不同的臨床株表皮葡萄球菌內(nèi)化作用強(qiáng)弱也不同。在有成骨細(xì)胞存在的情況下，某些菌株在萬(wàn)古霉素作用2小時(shí)后，用PBS洗去萬(wàn)古霉素，仍可在劃板培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)在血瓊脂培養(yǎng)板上。這種現(xiàn)象的發(fā)生可能是因?yàn)榧?xì)菌與成骨細(xì)胞通過某種機(jī)制發(fā)生關(guān)聯(lián)，使萬(wàn)古霉素對(duì)細(xì)菌的殺傷作用減弱，或因?yàn)榧?xì)菌有在空間內(nèi)平均分布的趨勢(shì)，萬(wàn)古霉素停止作用后細(xì)胞內(nèi)存活的細(xì)菌重新移行到細(xì)胞外。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，纖維蛋白原及JDBM鎂合金浸提液對(duì)實(shí)驗(yàn)細(xì)菌的內(nèi)化無(wú)明顯影響。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R318.08

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本文編號(hào)：2305618