【摘要】：研究背景：頭面部軟骨缺損是整形外科常見的疾病,采用組織工程技術修復頭面部軟骨缺損具有廣闊的臨床應用前景。然而,這項技術至今并未真正應用于臨床,主要瓶頸在于工程化軟骨在具有完整免疫力的大動物體內構建穩(wěn)定性很低并無法長期存活。究其原因,構建軟骨最常用的PGA/PLA支架材料在體內快速降解引起的無菌性炎癥反應是干擾大動物體內軟骨再生的主要原因,并且這是一種以巨噬細胞參與為主的固有免疫反應。因此,解決問題的關鍵在于如何有效地抵抗或避免這種以巨噬細胞參與為主的固有免疫反應。首先,大量文獻報道,骨髓間充質干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)除具備基本的干性和低免疫原性外,還對機體多種免疫細胞具有免疫調節(jié)作用。那么,由BMSCs構建的工程化軟骨是否具有抑制以巨噬細胞介導的固有免疫反應,從而改善其在大動物體內的形成質量需要進一步探索；此外,優(yōu)化體外構建技術,通過延長體外培養(yǎng)時間促進PGA/PLA的降解,或單純應用軟骨細胞的方式構建軟骨以避免材料引起的炎癥反應,是否能有效改善工程化軟骨在大動物體內的組織形成也需要進一步探索。研究目的：1.明確不同種子細胞及應用方案在大動物皮下的構建效果2.明確基于BMSCs構建的組織工程軟骨對巨噬細胞的免疫調節(jié)作用,并探討其相關機制。3.明確PGA/PLA體外殘留量對工程化軟骨在大動物皮下軟骨形成的影響4.明確應用單純軟骨細胞膜片構建的軟骨在大動物皮下的組織形成質量研究方法和結果：1.基于PGA/PLA的組織工程軟骨在大動物體內構建穩(wěn)定性的研究1.1 不同種子細胞構建的組織工程軟骨在大動物體內轉歸的研究方法：將豬耳廓軟骨細胞、BMSCs以及兩者1：1混合分別接種至PGA/PLA支架材料構建工程化軟骨,體外培養(yǎng)8周后取材,首先進行組織學、生物學及生物力學檢測,并回植入豬自體皮下,規(guī)定時間內取材,比較不同時期三者在豬自體皮下軟骨形成質量及炎癥反應。結果：豬耳廓軟骨細胞、BMSCs以及1：1混合復合PGA/PLA支架,體外培養(yǎng)8周后均能形成良好的軟骨組織,組織學、總膠原及楊氏模量方面無明顯差異。將三者植入豬自體皮下后2周,BMSCs組維持了完整的軟骨結構,1：1組和軟骨細胞組均遭到不同程度的破壞；體內植入后8周,BMSCs組仍可見部分軟骨組織,1：1和軟骨細胞組遭到嚴重破壞。1.2 BMSCs構建的組織工程軟骨對巨噬細胞極化作用的研究方法：耳廓軟骨細胞、BMSCs以及1：1混合復合PGA/PLA支架,以單純PGA/PLA支架為對照,體外培養(yǎng)8周后植入豬自體皮下,定期取材,比較各組體內多核異物巨細胞數(shù)量以及巨噬細胞CD68和CD206的表達。同時,將上述三組體外培養(yǎng)8周后的工程化軟骨與激活的巨噬細胞以transwell勺方式共培養(yǎng)24小時,采用免疫熒光、Real time PCR、Elisa等方法檢測巨噬細胞免疫表型的改變。結果：多核異物巨細胞和CD68陽性巨噬細胞在BMSCs組浸潤最少,PGA/PLA支架組最高,1：1和軟骨細胞組無明顯差異；M2型巨噬細胞特異表面標志CD206在BMSCs組表達最高,PGA/PLA支架組最低。體外共培養(yǎng)模型進一步驗證BMSCs構建的工程化軟骨與巨噬細胞共培養(yǎng)后高表達CD206、IL-10、Arg-1等抗炎因子,低表達IL-1β和TNF-α等促炎因子,提示BMSCs構建的工程化軟骨具有促進巨噬細胞向M2型極化的作用。1.3 PGA/PLA殘留量對工程化軟骨在大動物體內軟骨形成的影響方法：分別以軟骨細胞和BMSCs為種子細胞復合PGA/PLA,體外培養(yǎng)8周、12周、16周,比較體外培養(yǎng)不同時間點形成的工程化軟骨在組織學、生物學水平的差異,并計算體外PGA/PLA殘留量、殘留PGA直徑。對比體外培養(yǎng)不同時間點后植入豬自體皮下2周、8周所對應的軟骨形成及炎癥反應。結果：分別應用軟骨細胞和BMSCs構建的工程化軟骨延長體外培養(yǎng)時間,可見PGA/PLA殘留量逐漸減少,殘留PGA直徑逐漸變細,植入豬自體皮下后2周,體外12周和16周組軟骨形成均較體外8周組好,但在植入后8周,各組工程化軟骨均遭到破壞。不同培養(yǎng)時間的BMSCs組在植入后2周均維持了完整的軟骨形態(tài),但體外12周和16周組在體內軟骨形成厚度明顯大于8周組。2.應用單純軟骨細胞膜片在大動物體內再生軟骨組織的研究方法：將P3代豬耳廓軟骨細胞以超高密度“細胞堆積”的方法形成軟骨細胞膜片,體外培養(yǎng)12周,組織學檢測膜片形成質量,并植入豬自體皮下,觀察植入后2周、8周、24周再生軟骨的形成情況。結果：軟骨細胞通過超高密度“細胞堆積”的方法可以在體外形成均質的和具有一定厚度的軟骨細胞膜片,植入豬自體皮下后未見明顯炎癥反應,軟骨細胞膜片逐漸成熟并能長期存活,體內24周組織學結構與正常軟骨組織相似。研究結論：1.單純耳廓軟骨細胞、BMSCs、以及耳廓軟骨細胞與BMSCs (1:1)復合PGA/PLA支架材料在成軟骨誘導液作用下體外培養(yǎng)8周均能構建出優(yōu)質的軟骨組織,將三組工程化軟骨植入豬自體皮下,僅BMSCs組在植入后2周維持了完整的軟骨結構。2.基于BMSCs構建的工程化軟骨具有促進M2型巨噬細胞極化從而抑制炎癥反應,改善工程化軟骨在大動物皮下的組織形成質量。同時,通過體外共培養(yǎng)模型進一步驗證BMSCs構建的工程化軟骨是通過促進CD206、IL-10、Arg-1等抗炎因子的合成,降低IL-1β和TNF-α等促炎因子的合成完成巨噬細胞M2型的極化。3.工程化軟骨在體外培養(yǎng)至16周,PGA仍不能完全降解。PGA/PLA體外殘留量會影響工程化軟骨在豬自體皮下早期的軟骨形成。體外培養(yǎng)時間越長,PGA/PLA殘留量越少,體內2周的軟骨形成越好。4.軟骨細胞膜片因不含外源性材料,避免了材料引起的炎癥反應對軟骨形成的影響,植入豬自體皮下后可形成均質、成熟的軟骨組織,并可長期存活。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R318.08;R622

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本文編號：2305496