【摘要】：G-四聯(lián)體(G4-DNA)是DNA的一種特殊二級結(jié)構(gòu)。它是一條富含G堿基的短鏈,4個(gè)G堿基通過Hoogsteen氫鍵自組裝成G-四分體,多個(gè)G-四分體通過π-π 堆積作用形成G-四聯(lián)體。人類基因組中含有高達(dá)376000個(gè)G4-DNA結(jié)構(gòu),廣泛的存在于染色體端粒區(qū)域、基因的啟動(dòng)子區(qū)域、免疫蛋白開關(guān)區(qū)域以及外顯子區(qū)域當(dāng)中。G4-DNA結(jié)構(gòu)參與了諸如細(xì)胞的增殖、基因的表達(dá)與調(diào)控、蛋白質(zhì)的翻譯等生物功能,因此對G4-DNA的高靈敏度、高準(zhǔn)確度、快速的分析與相關(guān)疾病的診斷方法具有重要的研究意義。近年來,熒光編碼微球技術(shù)取得了很大的進(jìn)展,可廣泛應(yīng)用于核酸、蛋白質(zhì)、糖類等生物組分的高通量、高靈敏度、快速的分析。其中量子點(diǎn)熒光編碼微球既利用了量子點(diǎn)優(yōu)良的光學(xué)性質(zhì),又使得編碼更為多樣解碼更為方便。然而在大多數(shù)情況下其檢測靈敏度還無法達(dá)到臨床分析的要求,需要進(jìn)一步集成信號放大技術(shù)。滾環(huán)擴(kuò)增是一種高效的核酸檢測信號放大方法,具有成本較低、操作簡單、重復(fù)性好和無需改變溫度的優(yōu)點(diǎn)。本論文通過在二氧化硅包覆的量子點(diǎn)熒光編碼微球表面進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng),實(shí)現(xiàn)了對人類基因組不同區(qū)域的G4-DNA的高靈敏、多元檢測。論文主要研究內(nèi)容如下:1.使用高溫?zé)嶙⑸浞ê铣闪税l(fā)射峰分別為513 nm(綠色)和582 nm(橙色)的CdSe@ZnS量子點(diǎn)。使用分散聚合法合成了聚苯乙烯微球種子,在此基礎(chǔ)上使用種子聚合法合成了 PSDM介孔微球。使用“溶脹-揮發(fā)”法包裹橙色和綠色兩種量子點(diǎn)形成量子點(diǎn)熒光編碼微球。利用Stober法制備了二氧化硅包覆的量子點(diǎn)編碼微球(Qbead@Si02)。所構(gòu)建的Qbead@Si02具有優(yōu)良的熒光穩(wěn)定性。2.發(fā)展出了 Qbead@Si02-RCA分析法用于G4-DNA的高靈敏檢測,檢測限達(dá)到XXfM。該分析法的主要操作步驟包括:通過羰基二亞胺反應(yīng)在Qbead@Si02-COOH表面偶聯(lián)capture probe序列,通過雜交固定Padlock DNA序列;靶標(biāo)G4-DNA與Padlock DNA雜交,PadlockDNA在T4連接酶作用下封閉成環(huán),并進(jìn)一步在酶催化作用下復(fù)制擴(kuò)增;ZnPc對RCA產(chǎn)物進(jìn)行染色;通過流式細(xì)胞術(shù)對ZnPc熒光信號進(jìn)行定量檢測。3.基于三個(gè)Qbead@Si02熒光編碼,利用Qbead@Si02-RCA分析法進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)了對三種G4-DNA序列的同時(shí)檢測,檢測特異性較好。
[Abstract]:G-quadruple (G4-DNA) is a special secondary structure of DNA. It is a short chain rich in G bases. Four G bases are self-assembled into G- tetrads by Hoogsteen hydrogen bonds, and many G- tetrads form G- tetrads by 蟺-蟺 stacking. The human genome contains as much as 376,000 G4-DNA structures, which are widely found in the telomere region of the chromosome, the promoter region of the gene, the switching region of the immune protein and the exon region, in which the. G4-DNA structure is involved in, for example, cell proliferation. Gene expression and regulation, protein translation and other biological functions, so G4-DNA high sensitivity, high accuracy, rapid analysis and diagnosis of related diseases have important significance. In recent years, fluorescent coding microspheres have made great progress and can be widely used in high throughput, high sensitivity and fast analysis of biological components such as nucleic acid, protein, sugar and so on. The quantum dot fluorescence coding microspheres not only make use of the excellent optical properties of quantum dots, but also make it more convenient to encode various codes and decode. However, in most cases, the detection sensitivity can not meet the requirements of clinical analysis, and further integration of signal amplification technology is needed. Rolling amplification is an efficient amplification method for nucleic acid detection signal, which has the advantages of low cost, simple operation, good repeatability and no need to change temperature. In this paper, the high sensitivity and multivariate detection of G4-DNA in different regions of the human genome was achieved by using a roller-ring amplification reaction on the surface of silica coated quantum dot fluorescence coded microspheres. The main contents of this paper are as follows: 1: 1. CdSe@ZnS quantum dots with emission peaks of 513 nm (green) and 582 nm (orange) were synthesized by high temperature thermal injection. The seeds of polystyrene microspheres were synthesized by dispersion polymerization, and PSDM mesoporous microspheres were synthesized by seed polymerization. Two kinds of quantum dots, orange and green, were encapsulated by "swelling and volatilization" method to form fluorescent coded microspheres of quantum dots. SiO2 coated quantum dot coded microspheres (Qbead@Si02) were prepared by Stober method. The constructed Qbead@Si02 has excellent fluorescence stability. 2. 2. A highly sensitive detection method for G4-DNA by Qbead@Si02-RCA analysis was developed, and the detection limit was up to XXfM.. The main operation steps of this method include: coupling capture probe sequence on Qbead@Si02-COOH surface by carbonyl diimide reaction, fixing Padlock DNA sequence by hybridization, and closing the ring of target G4-DNA and Padlock DNA hybridization Padlock DNA under the action of T4 ligase. Furthermore, the RCA products were stained with RCA products and the fluorescence signals of ZnPc were quantitatively detected by flow cytometry. Based on the three Qbead@Si02 fluorescence codes, the detection of three kinds of G4-DNA sequences at the same time was further realized by Qbead@Si02-RCA analysis, and the detection specificity was good.
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R318

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本文編號：2206210