本文關鍵詞：漢灘病毒感染HaCaT細胞誘導Ⅰ型干擾素產生及其分子機制的初步研究

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【摘要】：漢坦病毒（Hantavirus）是布尼亞病毒科（Bunyaviridae）漢坦病毒屬（Hantaviruses）家族成員，其基因組由大（L）、中（M）和�。⊿）三條單股負鏈RNA組成。L片段編碼RNA依賴的RNA聚合酶（Pol），S片段編碼病毒核衣殼蛋白（neucleocapsidprotein，NP），M片段編碼病毒的糖蛋白前體。漢坦病毒屬的漢灘病毒（Hantaan virus，HTNV）、漢城病毒（Seoul virus，SEOV）、普馬拉病毒（Puumala virus，PUUV）等感染引起的腎綜合征出血熱（hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS）主要流行于亞洲和歐洲國家；安第斯病毒（Andes virus，ANDV）、紐約病毒（New York virus，NYV）和辛諾柏病毒（Sin Nombre virus，SNV）等引起的漢坦病毒肺綜合征（hantaviruspulmonary syndrome，，HPS）主要流行于美洲國家，兩者均屬于病死率較高和病情較為嚴重的急性傳染病。我國是HFRS的流行大國，發(fā)病人數(shù)居全球首位。其臨床特征主要以發(fā)熱、出血、低血壓休克和急性腎臟功能損傷為主。 HFRS的發(fā)病機制及病理過程較為復雜。目前研究認為病毒一方面可直接感染臟器組織致使結構和功能異常，另一方面病毒感染機體激活機體的固有免疫應答和適應性免疫應答，致使機體內環(huán)境發(fā)生變化，釋放炎癥介質、血管活性因子和多種細胞因子，而最終導致機體內環(huán)境紊亂和器官功能失調。 漢坦病毒的主要存儲宿主是嚙齒類動物。其傳播途徑多樣，一般認為是人通過接觸帶毒嚙齒類動物的排泄物與分泌物經(jīng)傷口、氣溶膠、飲食而感染，其中被帶毒嚙齒類動物輕微咬傷也可導致感染，而關于咬傷引起病毒感染的細胞學基礎及發(fā)生的詳細分子事件尚不清楚。皮膚角質形成細胞（keratinocyte，KC）是人表皮組織的主要組成細胞，也被認為是具有重要功能的非專業(yè)性抗原呈遞細胞（antigen presentingcell，APC），可分泌眾多細胞因子如干擾素、白細胞介素（IL-1α、IL-1β、IL-3、IL-7、IL-8、IL-10、IL-l8等）、集落刺激因子（G-CSF、GM-CSF）、腫瘤壞死因子、生長因子、趨化因子等來抑制外來病原體的感染，也可通過表達MHCⅡ類抗原、吞噬加工抗原等參與抗原遞呈而發(fā)揮免疫防御作用。我們推測在經(jīng)帶毒嚙齒類動物咬傷而感染漢坦病毒這一過程中，病毒有可能感染人KC細胞并誘導機體的固有免疫應答與炎癥反應，為控制病毒感染或病毒的進一步擴散提供可能。為此，本研究以永生化的人角質形成細胞系（HaCaT細胞，具有正常角質形成細胞的全部特性）為研究模型，觀察HTNV是否感染KC細胞，以及感染KC細胞之后能否激活Ⅰ型干擾素固有免疫應答以應對病毒感染，并進一步探討Ⅰ型干擾素應答中存在的可能機制，為闡明漢坦病毒感染致病過程中KC細胞可能作為一種潛在的靶細胞及發(fā)生的分子事件提供實驗依據(jù)。 【主要實驗方法和研究結果】 1. HTNV可感染HaCaT細胞，并能夠在其中復制增殖 用MOI=1的HTNV感染HaCaT細胞，6h和24h時分別收集細胞，在對細胞裂解物進行蛋白定量后，以核蛋白（nucleocapsid protein，NP）的單抗為一抗，采用Western blot檢測其中病毒的NP。結果顯示，病毒感染組在6h和24h均檢測到特異條帶，與NP的預期大小一致，而且24h的條帶明顯較強，未加病毒感染的對照組6h和24h均未檢測到相應的特異條帶。以NP的單抗為一抗，用免疫熒光法檢測病毒感染72h時細胞內病毒的NP，結果顯示，在胞漿中觀察到較強的特異性綠色熒光，即NP有特異的表達；未加病毒對照組中，胞漿內沒有觀察到特異的綠色熒光顆粒。以上結果表明，HTNV可感染HaCaT細胞，并能夠在其中復制增殖。 2. HTNV感染HaCaT細胞后可誘導表達IFNβ 用MOI=1的HTNV感染HaCaT細胞后，于1d和3d分別收集細胞，qRT-PCR分別檢測Ⅰ型干擾素IFNα和IFNβ的mRNA。結果顯示，與未感染對照組相比，病毒感染后細胞內IFNβ mRNA水平在1d和3d時均顯著升高，而IFNα mRNA水平在1d和3d時變化均不明顯。結果表明，HTNV感染HaCaT細胞誘導了Ⅰ型干擾素的產生，且以IFNβ為主。 3. HTNV感染HaCaT細胞可激活IFNβ啟動子 用Lipofectamine2000介導pRL-TK和含IFNβ啟動子的重組質粒IF△116共轉染HaCaT細胞，于6h后進行HTNV感染，24h后檢測熒光素酶活性。結果顯示，重組質粒IF△116轉染HaCaT細胞后經(jīng)HTNV感染，與未感染的細胞組相比熒光素酶活性明顯增強。該結果提示，HTNV感染后能明顯激活IFNβ啟動子。 4. HTNV感染HaCaT細胞可激活Ⅰ型干擾素應答通路中相關效應分子 用MOI=1的HTNV感染HaCaT細胞2h后繼續(xù)培養(yǎng)，于不同時間點分別收集細胞，并提取細胞RNA后進行反轉錄，qRT-PCR分別檢測了Ⅰ型干擾素應答通路中關鍵分子的表達水平。 模式識別受體（PRR）檢測結果顯示，與未感染對照組相比，病毒感染細胞組RIG-Ⅰ的mRNA水平在1d和3d時均顯著升高；MDA5的mRNA水平在1d時變化不明顯，在3d時mRNA水平顯著升高；而病毒感染細胞TLR3的mRNA水平在1d和3d時均無明顯升高。該結果表明，在HTNV激活的干擾素應答通路中，RIG-Ⅰ可能在病毒感染初期參與了HTNV的識別過程并進一步激活了下游信號轉導通路；隨后RIG-Ⅰ和MDA5在介導細胞內信號應答過程中共同發(fā)揮了重要作用；TLR3可能不參與HTNV感染HaCaT細胞的識別過程。 轉錄因子IRF3和IRF7檢測結果顯示，與病毒未感染對照組相比，病毒感染細胞組IRF3和IRF7的mRNA水平在1d時變化均不明顯，3d時二者的mRNA水平均明顯升高，其中IRF7的mRNA水平上調更為顯著；在病毒感染HaCaT細胞4h、6h和24h時，免疫熒光法檢測IRF3、IRF7和NF-κB/p65入核情況，結果顯示在感染6h時，細胞核內能觀察到明顯的IRF3綠色熒光，而IRF3在4h和24h時，IRF7和NF-κB/p65在4h、6h和24h時均未觀察到細胞核內有綠色熒光；隨后的雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)對NF-κB結合區(qū)激活情況檢測結果顯示，HTNV感染后，NF-κB信號沒有被明顯激活。以上結果提示，在病毒感染初期，活化的IRF3而非NF-κB可能首先入核介導了早期IFNβ基因的轉錄和調控，IRF7則可能在隨后Ⅰ型干擾素基因的轉錄調控中發(fā)揮主要作用。 轉錄因子STAT1和IRF9檢測結果顯示，與未感染對照組相比，病毒感染細胞組STAT1及IRF9的mRNA水平在1d時升高均不明顯，在3d時二者的mRNA水平均明顯升高；病毒感染HaCaT細胞4h、6h和24h時免疫熒光法檢測STAT1入核情況時，結果顯示在感染細胞24h時核內能觀察到明顯的綠色熒光，而4h和6h時未觀察到核內有綠色熒光；隨后用用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)對STAT1結合區(qū)激活情況進行檢測，結果顯示，HTNV感染后，STAT1信號被明顯激活。以上結果進一步驗證了在干擾素誘導生成的下游通路中磷酸化的STAT1和其他轉錄因子結合形成異三聚體后入核而啟動眾多ISG基因的轉錄和合成。 干擾素刺激因子（ISG）檢測結果顯示，與未感染對照組相比，病毒感染細胞組MxA、OAS1和IFIT1的mRNA水平在1d、3d和5d時均顯著升高；IFIT3的mRNA水平在1d時升高不明顯，在3d和5d時也明顯升高。MxA和OAS1的mRNA水平呈先上升后下降趨勢；IFIT1和IFIT3的表達呈持續(xù)上升趨勢。結果表明，HTNV感染的HaCaT細胞誘導產生的MxA和OAS1可能在感染早期發(fā)揮主要的抗病毒作用；IFIT1和IFIT3可能在病毒感染后期發(fā)揮重要的抗病毒作用。5. HTNV感染HaCaT細胞可誘導表達趨化因子CCL5和CXCL10 用MOI=1的HTNV感染HaCaT細胞，同時設病毒未感染對照組，于1d、3d和5d時分別收集細胞，qRT-PCR檢測CCL5和CXCL10的mRNA水平。結果顯示，HTNV感染后CCL5和CXCL10均被大量誘導表達，且CXCL10在1d時表達較為顯著。結果提示，CCL5在其受體的介導下可能主要參與病程后期的病毒清除及炎癥反應，而CXCL10可能在感染初期即參與了機體強烈的抗病毒反應。 【結論】 綜上所述，HTNV能夠感染人角質形成細胞系HaCaT細胞，感染細胞后誘導了IFNβ的產生，IFNβ又可引起細胞產生相應的ISG發(fā)揮抗病毒作用，與此同時HTNV感染HaCaT細胞還可產生趨化因子，趨化因子可能參與了機體的抗病毒應答及炎癥反應。本研究為進一步探索帶毒嚙齒類動物咬傷時KC細胞的固有免疫應答機制提供了實驗基礎。
【關鍵詞】：腎綜合征出血熱 漢灘病毒 人永生化的角質形成細胞（HaCaT細胞） Ⅰ型干擾素
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R373
【目錄】：

• 縮略語表5-8
• 中文摘要8-13
• Abstract13-18
• 前言18-21
• 文獻回顧21-35
• 1 材料35-39
• 1.1 細胞、病毒和質粒35
• 1.2 主要儀器35-36
• 1.3 主要試劑及配制36-39
• 2 方法39-45
• 2.1 HTNV 感染 HaCaT 細胞及其檢測39-40
• 2.2 HTNV 感染 HaCaT 細胞后Ⅰ型干擾素的檢測40-43
• 2.3 HTNV 感染 HaCaT 細胞后 PRRs 的 mRNA 表達水平檢測43
• 2.4 HTNV 感染 HaCaT 細胞后 IRF3、IRF7 和 NF-κB 的檢測43-44
• 2.5 HTNV 感染 HaCaT 細胞后 STAT1 和 IRF9 的檢測44
• 2.6 ISG 和趨化因子的 mRNA 表達水平檢測44-45
• 3 結果45-53
• 3.1 HTNV 感染 HaCaT 細胞的檢測結果45-46
• 3.2 HTNV 感染 HaCaT 細胞后Ⅰ型干擾素的檢測結果46-47
• 3.3 HTNV 感染 HaCaT 細胞后 PRRs 的 mRNA 表達水平檢測結果47-48
• 3.4 HTNV 感染 HaCaT 細胞后 IRF3、IRF7 和 NF-κB 的檢測結果48-50
• 3.5 HTNV 感染 HaCaT 細胞后 STAT1 和 IRF9 的檢測結果50-51
• 3.6 ISG 和趨化因子的 mRNA 表達水平檢測結果51-53
• 4 討論53-59
• 小結59-60
• 參考文獻60-73
• 個人簡歷和研究成果73-74
• 致謝74-75

【參考文獻】

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本文編號：982837