本文關鍵詞：MASP-2 EGF和SP功能區(qū)抗體制備及初步鑒定

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【摘要】：近年來,關于天然免疫識別學說--模式識別理論的提出推動了免疫學的發(fā)展。模式識別受體-病原體相關分子模式(pattern recognition receptor-pathogen associated molecule pattern, PRR-PAMP)的研究引起高度關注。甘露聚糖結合凝集素(mannose-binding lectin, MBL)是重要的PRR之一,在固有免疫中扮演重要角色。當MBL識別病原體時,其下游的蛋白酶MASP-2(mannose-binding lectin associated serine protease-2)通過裂解絲氨酸蛋白酶域N端的精氨酸-異亮氨酸間的肽鍵發(fā)生自激活作用,在補體激活的凝集素途徑中發(fā)揮重要作用。另有研究表明,MASP-2與腫瘤,感染性疾病和自身免疫性疾病有關。因此,對MASP-2的研究已成為研究天然免疫的熱點之一。MASP-2由6個功能區(qū)組成,其中EGF功能區(qū)含Ca2+結合模體,SP功能區(qū)具有較高的激活凝血酶能力,參與MASP-2的自激活。本課題擬在構建構建MASP-2EGF和SP原核表達載體重組質(zhì)粒的基礎上,在異丙基硫代半乳糖苷的作用下進一步誘導表達蛋白,純化后免疫小鼠制備多克隆抗體,以期為為后續(xù)檢測體液MASP-2含量、分析不同細胞MASP-2表達情況奠定基礎。 首先從胎肝提取總RNA,反轉錄合成cDNA后以此為模板,應用PCR技術擴增得到特異性EGF、SP基因,采用酚-氯仿抽提法提純PCR產(chǎn)物,對EGF、SP片段和pGEX-6p-2質(zhì)粒進行BamH I、Not I雙酶切,凝膠回收各片段,以T4DNA連接酶分別連接EGF和SP片段酶切產(chǎn)物與pGEX-6P-2載體構建重組質(zhì)粒。采用熱休克法分別將EGF、SP重組質(zhì)粒轉化導入E.coli BL21感受態(tài)細菌,轉化后菌液直接涂布于LB固體選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜。采用針對pGEX-6p-2質(zhì)粒通用引物的菌落PCR初篩LB平板上生長的單克隆菌落,將陽性擴增的單克隆接種于LB液體選擇培養(yǎng)液震蕩培養(yǎng)過夜,提取質(zhì)粒為模板,以載體通用引物分別和EGF、SP目的片段的特異引物進行cross-PCR鑒定,并同時進行BamH I、Not I雙酶切鑒定。Cross-PCR擴增陽性和雙酶切鑒定均正確的質(zhì)粒進行DNA序列測定鑒定重組質(zhì)粒正確性。序列測定結果與GenBank公布的masp-2EGF和SP標準序列比對完全一致,且沒有發(fā)現(xiàn)移碼現(xiàn)象,說明成功構建pGEX-6P-2-EGF、pGEX-6P-2-SP原核表達重組體。 確定重組表達載體成功構建后,轉化pGEX-6P-2-EGF和pGEX-6P-2-SP重組載體于E.coli BL21感受態(tài)細菌,將菌液涂布于LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜后挑取單個菌落,接種于LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜；次日擴大培養(yǎng)一定時間力(?)IPTG誘導表達,低溫離心并洗滌菌體沉淀后,再次低溫離心棄上清收集菌體；超聲裂解所獲菌體,分別收集上清和沉淀,制樣進行SDS-PAGE分析,考馬斯亮藍染色后分析蛋白表達形式,GST-EGF融合蛋白在上清表達,為可溶性蛋白；而SP融合蛋白只以包涵體形式存在,經(jīng)尿素處理后,純化GST-EGF和GST-SP融合蛋白。 最后分別用純化的GST-EGF和GST-SP融合蛋白免疫6-7周齡BALB/c小鼠,免疫完成后取小鼠血清分別檢測其抗體特異性和效價。大量誘導GST-EGF和GST-SP融合蛋白,分別于第0、21、35天對小鼠進行三次腹腔注射免疫,并設置對照組,末次免疫7天后取血,分離并保存血清,Western blotting檢測血清EGF、SP抗體特異性,間接酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測小鼠血清中EGF、SP抗體水平；EGF鼠抗血清效價達1：32000,SP鼠抗血清效價達1：40000,WB結果顯示融合蛋白組小鼠血清稀釋1000倍后仍有特異性目的條帶出現(xiàn),對照組不出現(xiàn),本實驗制得高特異性和高效價SP和EGF抗體。
【關鍵詞】：MASP-2 EGF SP 蛋白表達 抗體制備
【學位授予單位】：河北北方學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-10
• 英文~.寫10-12
• 前言12-14
• 實驗儀器與材料14-18
• 實驗方法和步驟18-35
• 結果35-39
• 附圖39-49
• 附表49-51
• 討論51-54
• 結論54-55
• 參考文獻55-61
• 綜述 MASPs的研究現(xiàn)狀61-77
• 參考文獻69-77
• 致謝77-78
• 個人簡歷78

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

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本文編號：982733