本文關(guān)鍵詞：抗腫瘤19肽在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達及其活性驗證

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【摘要】：抗腫瘤19肽為腫瘤抑素（tumstatin）靠近C端的185-203位氨基酸組成的肽段，具有直接抑制腫瘤細胞增殖和促進腫瘤細胞凋亡的作用。從動物中提取或人工合成抗腫瘤19肽成本較高，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，運用工程菌生產(chǎn)重組的抗腫瘤19肽將成為未來的一種發(fā)展趨勢。 本實驗將合成的抗腫瘤19肽基因連接到表達載體pET32a上，分別轉(zhuǎn)化到四種大腸桿菌BL21、BL21(DE3)、BL21(DE3)plysS和Rosetta(DE3)中，用IPTG誘導(dǎo)表達重組蛋白。將誘導(dǎo)出的蛋白進行SDS-PAGE蛋白電泳檢測，運用1D Gel Image Processing Software（Version5.0.0.16US）軟件分析凝膠電泳結(jié)果，大約在22kD處有條明顯的表達條帶,與推測的重組蛋白理論值大小相符，說明目的基因在重組菌中得到了表達，其中在BL21(DE3)菌種中重組蛋白的表達量最高，為18mg/L，命名為pET32a-19肽-BL21(DE3)，作為后續(xù)實驗的工程菌。 對pET32a-19肽-BL21(DE3)進行傳代培養(yǎng)15代，經(jīng)SDS-PAGE蛋白電泳檢測，重組蛋白的表達量沒有明顯變化，說明質(zhì)粒遺傳穩(wěn)定；利用單因素實驗和正交實驗對其發(fā)酵條件進行優(yōu)化，確定最佳發(fā)酵條件是培養(yǎng)基pH7.0、接種量3%、IPTG濃度0.1mmol/L、IPTG添加時間OD600=0.7、誘導(dǎo)溫度41℃和誘導(dǎo)時間5h，重組目的蛋白的表達量高達54.57mg/L。 通過超聲波破碎菌體，離心后的上清和沉淀進行SDS-PAGE蛋白電泳檢測，結(jié)果顯示重組蛋白主要以包涵體的形式表達。通過Ni Sepharose6Fast Flow親和層析的方法純化重組蛋白，對純化出的重組蛋白進行SDS-PAGE蛋白電泳檢測，純度達到95%以上。 通過梯度透析法復(fù)性重組蛋白，，真空冷凍干燥后獲得重組蛋白干粉。利用MTT的方法進行活性實驗，當(dāng)重組蛋白濃度達到200μg/mL時對人肝癌細胞(SMMC7721)抑制率為70%。
【關(guān)鍵詞】：抗腫瘤19肽 表達 純化 復(fù)性 抗腫瘤
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R378;Q78
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-6
• 第一章 前言6-13
• 1.1 腫瘤抑素6-7
• 1.2 抗腫瘤 19 肽7
• 1.3 國內(nèi)外研究現(xiàn)狀7-8
• 1.4 大腸桿菌表達系統(tǒng)8-9
• 1.5 重組蛋白包涵體9-11
• 1.6 研究的目的和意義11
• 1.7 實驗路線11-13
• 第二章 抗腫瘤 19 肽在大腸桿菌中的融合表達13-29
• 2.1 材料與方法13-19
• 2.2 結(jié)果與分析19-27
• 2.3 討論27-28
• 2.4 小結(jié)28-29
• 第三章 重組蛋白的純化與復(fù)性29-35
• 3.1 材料與方法29-32
• 3.2 結(jié)果與分析32-33
• 3.3 討論33-34
• 3.4 小結(jié)34-35
• 第四章 重組蛋白的抗腫瘤活性研究35-40
• 4.1 材料與方法35-37
• 4.2 結(jié)果與分析37-38
• 4.3 討論38-39
• 4.4 小結(jié)39-40
• 結(jié)論40-41
• 參考文獻41-46
• 作者簡介46-47
• 致謝47

【參考文獻】

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本文編號：788834