本文關鍵詞：抗人降鈣素原特異性單克隆抗體的制備及其免疫傳感器的初步研究

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【摘要】：細菌感染導致的抗生素濫用致細菌耐藥是我國乃至全球范圍最突出的公共衛(wèi)生問題之一，并且由其導致的膿毒血癥也嚴重危害著人類健康，成為非心臟ICU死亡的主要原因。普通的細菌感染本身并不可怕，只要早期診斷明確并針對性治療，不會造成嚴重后果。所以，細菌感染的早期診斷和鑒別診斷極為重要。臨床常用傳統(tǒng)感染診斷指標主要有外周白細胞計數(shù)(WBC)、血液中C反應蛋白(CRP)和血液細菌培養(yǎng)等，但都存在費時、誤差大、靈敏度低、特異性差等缺點，因此，應用新的標志物來診斷細菌感染性疾病非常必要。降鈣素原(PCT)是一種有116個氨基酸殘基組成、分子量為13kDa的糖蛋白，血清降鈣素的前體物。生理情況下，血中PCT濃度極低，基本檢測不到，但在一些細菌感染性疾病，包括細菌感染引發(fā)的全身炎癥反應、敗血癥或膿毒性休克等患者中血清PCT水平顯著升高，并且和疾病嚴重程度呈正相關。因此，PCT可作為一種高靈敏的新的炎癥檢測指標。在臨床中，血液中PCT的濃度變化應用于多種感染性疾病的診斷與鑒別診斷，可對感染性疾病進行感染程度的判斷和治療效果的評定，同時，可指導抗生素用藥。PCT的便利、快速和準確測定為細菌性感染的診斷及治療提供了新的可靠依據(jù)。目前PCT的主要測定方法包括定性(半定量)測定和定量測定兩種方式。主流的診斷產(chǎn)品均為國外進口，價格昂貴。因此，研發(fā)具有自主知識產(chǎn)權、有較高靈敏度和特異性的PCT檢測技術和相應產(chǎn)品，具有重要的社會和經(jīng)濟價值。 主要研究內(nèi)容和結果： 1.重組PCT蛋白的原核表達與純化 從GENBANK獲得PCT編碼基因及其他相關分子結構等基本信息，通過Graphicalcodon usage analyzer (http://guca.schoedl.del)分析密碼子偏性并將基因序列5’端和3’端分別加入酶切位點及保護堿基后進行全基因合成。通過構建PCT原核表達載體，將PCT的DNA序列克隆入pET28a，再將重組質(zhì)粒pET28a-PCT轉化入大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)1mmol/L IPTG誘導表達表達6h，得到融合蛋白，分子量約15kDa。15%SDS-PAGE鑒定表達蛋白破菌后在上清里，為可溶性表達。進行鎳金屬螯合層析純化后鑒定，15%SDS-PAGE圖譜顯示幾乎呈單一條帶，分析結果顯示其純度可達90%以上。用Lowry氏法測得蛋白濃度為5mg/ml。純化的重組蛋白PCT經(jīng)特異性鑒定，即為目標蛋白，可用于免疫檢測標準品及單克隆抗體制備的篩選。 2.抗人PCT單克隆抗體的制備鑒定及初步應用 依據(jù)在線軟件預測，綜合分析ChouFasman法預測蛋白結構β轉角、KarplusSchulz法預測蛋白柔韌性、Emini法預測抗原表面的可及性、KolaskarTongaonkar法分析蛋白質(zhì)抗原性、Bepipred法預測線性抗原表位、Parker法分析蛋白質(zhì)疏水性等獲得三段表位肽。人工合成3個肽段與BSA交聯(lián)作為免疫原免疫Balb/c小鼠，細胞融合后通過復查及亞型分析保留7株抗體。采集小鼠單抗腹水經(jīng)Protein A HP.F.F親和純化柱純化，純化后的抗體用間接ELISA法檢測效價，均在1:64000以上，選出三株結合能力高、效果好的PCT單克隆抗體2-D7、2-H12、4-H12并對其抗體其他特性進行鑒定。最終選出特異性、效價和親和力最好的單克隆抗體2-D7用Western blot和免疫組化進一步鑒定其特異性。由Western blot結果得出單克隆抗體2-D7能結合重組PCT抗原，與無關蛋白H-FABP不反應，表明其有好的特異性；免疫組化結果顯示，2-D7能特異識別正常甲狀腺及甲狀腺癌組織中PCT蛋白，并初步鑒定PCT抗原在甲狀腺癌組織有較高表達。 之后，用單克隆抗體2-D7作為包被抗體，酶標PCT抗體作為檢測抗體，成功建立了重組蛋白PCT檢測的ELISA體系。此免疫檢測體系經(jīng)過優(yōu)化后，對60例細菌培養(yǎng)陽性血清和40例健康體檢血清進行了檢測，正常組PCT濃度為4.41±2.76ng/ml，感染組PCT濃度為35.70±15.03ng/ml，結果顯示二者之間具有顯著性差異(*P0.05)，說明建立的配對抗體檢測體系能夠區(qū)分正常血清與感染血清之間的差異。再用本研究抗體檢測體系與安圖公司配對抗體對臨床血清進行檢測，本研究抗體檢測陽性率為83.3%，，而安圖公司抗體陽性率為86.67%，所得結果表明我們的抗體檢測水平已基本達到安圖公司抗體檢測水平。所得單克隆抗體為下一步PCT檢測的研究提供了堅實的基礎。 3.抗人PCT免疫傳感器檢測的初步研究 電化學發(fā)光免疫傳感器由于其簡便、快速、靈敏度高、選擇性好等特點具有良好應用前景，尤其在臨床檢測方面得到越來越多的關注。我們首先將玻碳電極在L-Cys中電聚合在表面成膜，同時制備二抗生物偶合物GRA-Pd-PtNPs@anti-PCT-GOD，通過層層自組裝修飾于電極表面，加入魯米諾-H2O2共反應試劑，ECL信號顯著增高，達到理論預期效果，成功制備了PCT夾心式電化學發(fā)光免疫傳感器。對PCT免疫傳感器各項性能進行了檢測，結果表明免疫傳感器各項性能良好。同時，模擬人體正常環(huán)境加入人血清進行PCT檢測，結果證明該免疫傳感器可以用于臨床實際樣品的檢測。結果表明電化學發(fā)光免疫傳感器對PCT的檢測是可行的，為后續(xù)的新納米材料的使用、新檢測方法等的研究提供了新思路，也為進一步大樣本檢測研究、實現(xiàn)臨床應用等奠定了基礎。
【關鍵詞】：降鈣素原 單克隆抗體 電化學發(fā)光 免疫傳感器 ELISA
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R392;TP212.3
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• Abstract6-9
• 摘要9-12
• 第一章 前言12-15
• 1.1 選題依據(jù)12
• 1.2 研究背景12-13
• 1.3 研究意義13-14
• 1.4 研究內(nèi)容14
• 1.5 研究方法14-15
• 第二章 重組 PCT 蛋白的原核表達與純化15-31
• 2.1 材料與方法15-24
• 2.2 結果24-29
• 2.3 討論29-31
• 第三章 抗人 PCT 單克隆抗體的制備鑒定及初步應用31-48
• 3.1 材料與方法31-37
• 3.2 結果37-46
• 3.3 討論46-48
• 第四章 抗人 PCT 免疫傳感器檢測的初步研究48-56
• 4.1 材料與方法48-51
• 4.2 結果51-54
• 4.3 討論54-56
• 全文總結56-57
• 參考文獻57-63
• 文獻綜述63-71
• 參考文獻67-71
• 攻讀學位期間的研究成果71-72
• 致謝72

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 郭杰標;郭銳;劉艷華;;以抗體競爭結合抗原測定單抗親和力常數(shù)的研究[J];南方醫(yī)科大學學報;2006年07期

2 何建平,申昆玲,林影,吳明昌,王詠紅,楊學芳,王亞娟,邵芳;前降鈣素對新生兒重癥感染的診斷價值[J];首都醫(yī)科大學學報;2005年05期

本文編號：784162