發(fā)布時(shí)間：2017-08-17 15:41

  本文關(guān)鍵詞：蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1抑制劑篩選模型的構(gòu)建及應(yīng)用

  更多相關(guān)文章： SHP-1 抑制劑 高通量篩選 J11310 糖尿病 葡萄糖消耗 AMPK IRS

【摘要】：蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatases, PTPs）是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的重要調(diào)節(jié)因子，與人類疾病密切相關(guān)。SHP-1是含有SH2結(jié)構(gòu)域的具有高度保守序列的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶的亞家族中的重要成員，研究表明，PTPs與糖尿病患者血糖控制以及糖尿病血管并發(fā)癥關(guān)系密切。尋找蛋白酪氨酸磷酸酶的高活性抑制劑對(duì)糖尿病和肥胖癥治療有著廣闊的應(yīng)用前景。 本課題我們從人腦組織中獲取mRNA，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增出目標(biāo)cDNA，構(gòu)建蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1-pEASY-E1重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)E.coli TOP10感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行驗(yàn)證，將測(cè)序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli Transetta感受態(tài)細(xì)胞中表達(dá)SHP-1，獲得具有生物活性的體外重組SHP-1蛋白。同時(shí)對(duì)表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明20℃，0.4mmol/L IPTG對(duì)表達(dá)菌株進(jìn)行誘導(dǎo)時(shí)，SHP-1在體外高效穩(wěn)定的表達(dá)。采用我們體外表達(dá)獲得的蛋白建立SHP-1高通量篩選模型，對(duì)多種化合物用SHP-1抑制劑篩選模型進(jìn)行篩選，尋找高活性的蛋白酪氨酸磷酸酶的抑制劑，結(jié)果獲得活性化合物J11310。 實(shí)驗(yàn)中以人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞和大鼠骨骼肌成肌L6細(xì)胞為研究對(duì)象，選用胰島素30nM作為陽(yáng)性對(duì)照對(duì)照，評(píng)價(jià)了J11310對(duì)細(xì)胞糖代謝的影響。結(jié)果表明，樣品J11310對(duì)HepG2細(xì)胞和L6細(xì)胞無(wú)毒性，可劑量依賴性的促進(jìn)HepG2和L6細(xì)胞葡萄糖消耗，當(dāng)濃度為1μg/mL時(shí)能顯著性促進(jìn)細(xì)胞葡萄糖消耗。提示樣品J11310的作用機(jī)制可能是通過(guò)促進(jìn)肝臟和外周對(duì)葡萄糖的利用起到降葡萄糖作用。在HepG2細(xì)胞中加入胰島素，控制樣品的有無(wú)，以羅格列酮10-5M為陽(yáng)性對(duì)照，比較細(xì)胞葡萄糖消耗量以評(píng)價(jià)樣品有無(wú)胰島素的協(xié)同作用。結(jié)果顯示，J11310在HepG2細(xì)胞中有較好的胰島素協(xié)同性，作用強(qiáng)于羅格列酮，以1μg/mL作用最強(qiáng)，隨著濃度降低，樣品對(duì)葡萄糖消耗的協(xié)同作用逐漸減弱，在10-4μg/mL，10-5μg/mL時(shí)無(wú)協(xié)同作用。用不同濃度四氧嘧啶對(duì)RINm5F細(xì)胞進(jìn)行損傷，樣品不同濃度的J11310均對(duì)損傷的胰島細(xì)胞RINm5F無(wú)保護(hù)作用。用細(xì)胞免疫熒光方法檢測(cè)細(xì)胞中PGC-1α、Pi-AMPK、Pi-IRS的表達(dá)量，結(jié)果顯示，樣品J11310與HepG2細(xì)胞作用后，磷酸化AMPK以及磷酸化IRs表達(dá)量增加，對(duì)PGC-1a的表達(dá)量無(wú)明顯影響。這提示，J11310可能通過(guò)激活A(yù)MPK活性發(fā)揮葡萄糖脂代謝調(diào)控作用，同時(shí)還提高了IRS磷酸化水平，繼而激活下游胰島信號(hào)的傳遞，促進(jìn)血液中葡萄糖向細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)而降低血糖含量。 以上研究工作為進(jìn)一步尋找發(fā)現(xiàn)SHP-1的高活性抑制劑，和評(píng)價(jià)化合物生物活性打下了基礎(chǔ)。同時(shí)為尋找治療糖尿病和肥胖癥的藥物提供新的研究思路，，有著重要的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用前景。
【關(guān)鍵詞】：SHP-1 抑制劑 高通量篩選 J11310 糖尿病 葡萄糖消耗 AMPK IRS
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R3416;R587.1
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-8
• 目錄8-11
• 前言11-21
• 參考文獻(xiàn)17-21
• 第一章 蛋白酪氨酸磷酸酶 SHP-1 基因克隆與表達(dá)21-29
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料21
• 1.1 菌株與主要試劑21
• 1.2 主要儀器21
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法21-23
• 2.1 人 SHP-1 全長(zhǎng)基因的克隆21-22
• 2.2 重組質(zhì)粒 SHP-1-pEASY-E1 的構(gòu)建及鑒定22
• 2.3 重組質(zhì)粒在原核細(xì)胞中的表達(dá)及鑒定22-23
• 3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果23-25
• 3.1 人源 SHP-1 cDNA 全長(zhǎng)的克隆23
• 3.2 重組質(zhì)粒 SHP-1-pEASY-E1 的篩選與鑒定23-24
• 3.3 SHP-1 在原核細(xì)胞中的表達(dá)24
• 3.4 SHP-1 原核表達(dá)條件的優(yōu)化24-25
• 4. 小結(jié)與討論25-27
• 參考文獻(xiàn)27-29
• 第二章 SHP-1 抑制劑篩選模型的建立與抑制劑的篩選29-37
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料29-30
• 1.1 菌株29
• 1.2 試劑29
• 1.3 主要儀器29
• 1.4 主要試劑的配制29-30
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法30
• 2.1 SHP-1 酶濃度測(cè)定30
• 2.2 SHP-1 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)分析30
• 2.3 SHP-1 抑制劑高通量篩選模型的建立30
• 2.4 篩選模型的驗(yàn)證與樣品 J11310 對(duì) SHP-1 抑制率的測(cè)定30
• 3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果30-32
• 3.1 SHP-1 的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)分析30-31
• 3.2 SHP-1 抑制劑的篩選模型31-32
• 3.3 NaVO4 對(duì) SHP-1 的抑制作用32
• 3.4 J11310 對(duì) SHP-1 的抑制作用32
• 4．小結(jié)與討論32-35
• 參考文獻(xiàn)35-37
• 第三章 酪氨酸磷酸酶抑制劑在細(xì)胞水平上降糖效果評(píng)價(jià)37-49
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料37-38
• 1.1 細(xì)胞37
• 1.2 藥品和試劑37-38
• 1.3 主要儀器38
• 1.4 主要試劑配制38
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法38-40
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)38
• 2.2 細(xì)胞活力的測(cè)定38-39
• 2.3 細(xì)胞葡萄糖消耗的測(cè)定39
• 2.4 胰島素的協(xié)同作用的測(cè)定39-40
• 3．實(shí)驗(yàn)結(jié)果40-44
• 3.1 61 個(gè)樣品濃度為 10μg/mL 時(shí)對(duì) HepG2 細(xì)胞葡萄糖消耗的影響40-41
• 3.2 J11310 對(duì) HepG2 細(xì)胞葡萄糖消耗的影響41-43
• 3.3 樣品中對(duì) HepG2 細(xì)胞胰島素協(xié)同作用的影響43-44
• 4．小結(jié)與討論44-47
• 參考文獻(xiàn)47-49
• 第四章 酪氨酸磷酸酶抑制劑 J11310 降糖機(jī)制的研究49-60
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料49-50
• 1.1 細(xì)胞49
• 1.2 藥品和試劑49
• 1.3 主要試劑的配制49
• 1.4 主要儀器49-50
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法50-52
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)50
• 2.2 RINm5F 細(xì)胞四氧嘧啶損傷保護(hù)實(shí)驗(yàn)50
• 2.3 細(xì)胞免疫熒光50-51
• 2.4 細(xì)胞總 RNA 的提取及濃度測(cè)定51
• 2.5 Real-time PCR51-52
• 3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果52-56
• 3.1 J11310 對(duì)四氧嘧啶損傷 RINm5F 細(xì)胞的影響52-53
• 3.2 J11310 對(duì) HepG2 細(xì)胞 PGC-1α，p-AMPK，p-IRS 表達(dá)量的影響53-54
• 3.3 J11310 對(duì) HepG2 細(xì)胞中 SHP1 mRNA 表達(dá)的影響54-56
• 4. 小結(jié)與討論56-59
• 參考文獻(xiàn)59-60
• 致謝60-61

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 張佳林;鐘嘉明;張成鈞;崔雪陽(yáng);;“永生化”胰島β細(xì)胞系研究進(jìn)展[J];生物醫(yī)學(xué)工程與臨床;2009年04期

2 王辰,王瀝,楊澤;蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)與2型糖尿病及肥胖的關(guān)系[J];遺傳;2004年06期

本文編號(hào)：689822