本文關鍵詞：新生大鼠骨骼肌肌源性干細胞的分離、純化、培養(yǎng)和鑒定

  更多相關文章： 肌源性干細胞 差速貼壁 免疫細胞化學染色 原代培養(yǎng) 生長曲線

【摘要】：目的：肌源性干細胞（muscle derived-stem cells，MDSCs）移植治療壓力性尿失禁（SUI）的研究深受關注，傳統(tǒng)的治療方法長期療效不理想且并發(fā)癥多，隨干細胞研究的深入，干細胞移植成為肌肉組織損傷修復的一種重要手段，同時也為SUI的根本治療帶來希望。其中MDSCs倍受關注，它是肌肉中一種高度未分化的多潛能干細胞，具有體外分裂增殖快、自我更新、多向分化潛能和移植后存活率高等特點。并且取材資源豐富，操作方便，安全性高，是一種理想的種子細胞。由于肌肉組織中MDSCs數量少，所以MDSCs的分離和體外培養(yǎng)是進行移植的關鍵。本實驗運用改良酶消化法和差速貼壁法分離純化出MDSCs，通過細胞免疫組織化學染色進行鑒定，并對其體外培養(yǎng)進行密切觀察，掌握穩(wěn)定的分離純化和培養(yǎng)方法，為將來移植治療SUI提供重要的實驗依據。 方法： 1骨骼肌細胞的消化分離：實驗動物為清潔級新生SD（Sprayue-Dawley）大鼠，雌雄不限。75%酒精浸泡窒息處死后，取下四肢骨骼肌并剪成碎塊（約1mm~3），PBS緩沖液吹打沖洗，靜置后去除上清液，加入約2倍體積的混合酶（2.4u/ml Dispase II、0.5%I型膠原酶，2.5mmol/L CaCl2），37℃水浴箱消化約1小時，加入生長培養(yǎng)基終止消化，過濾后離心棄上層液，重懸細胞后進行培養(yǎng)（37℃，5%CO2）。 2MDSCs的分離、純化和培養(yǎng)：培養(yǎng)2小時后貼壁細胞記為PP1，將上層液中未貼壁的細胞吸出后繼續(xù)培養(yǎng)。24小時后，貼壁細胞記為PP2。每24小時進行差速貼壁培養(yǎng)，直到獲得PP6。PP6培養(yǎng)3天后換液，每2~3天換液1次，待70~80%融合后傳代培養(yǎng)。用0.25%胰蛋白酶消化細胞，加入胎牛血清終止消化，按1:2的比例進行傳代培養(yǎng)。 3MDSCs生長曲線的測定：取MDSCs傳代培養(yǎng)的一代、四代和七代細胞，0.25%胰酶消化后，以3×10~4個/ml的密度接種于24孔培養(yǎng)板，每日隨機選取3孔進行細胞計數，共記錄8日，取平均值繪制細胞生長曲線。 4MTT比色法觀察不同接種密度對MDSCs生長的影響：取MDSCs傳代細胞，調節(jié)細胞密度分別為2、4、6、8、10、12、15×10~5個/ml，接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)48小時后，每孔加入20ulMTT（5mg/ml），37℃避光培養(yǎng)4小時后棄上清液，每孔加入100ul二甲基亞砜（DMSO），振蕩10分鐘使結晶物完全溶解，在490nm處檢測吸光度值。 5MDSCs的鑒定：對獲取的MDSCs（PP6）以及MDSCs傳一代、四代、七代進行Desmin、Sca-1抗體免疫細胞化學染色，對PP1~PP6進行Desmin免疫細胞化學染色，以成纖維細胞作為陰性對照，在顯微鏡下觀察，以胞膜和/或胞漿內出現棕黃色顆粒判定為陽性，每組選取不同的視野進行計算陽性細胞占細胞總數的百分比。 6統(tǒng)計學處理：使用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理實驗數據，并進行統(tǒng)計學分析，P0.05認為有統(tǒng)計學意義。 結果：1MDSCs的消化、分離、純化和細胞形態(tài) 骨骼肌經過混合酶消化后得到肌纖維碎片、骨骼肌細胞、血細胞、成纖維細胞和內皮細胞等的混合物，用差速貼壁法將快速貼壁細胞與慢速貼壁細胞逐步分離，便可獲得MDSCs。PP1、PP2以成纖維細胞為主，細胞數量多，貼壁迅速，增殖快，5天左右完全融合；PP3、PP4以肌細胞為主，數量減少，增殖較快，1周左右完全融合；PP6貼壁的細胞數量明顯減少，多為小圓形或梭形，體積較小，折光性好，增殖緩慢，另有少量懸浮的細胞。培養(yǎng)72小時后細胞數量增多，呈現梭形或紡錘形，有小克隆團形成，分散生長在瓶底。1周左右細胞明顯分裂增殖，數量增多，密度增加，形成眾多細胞團，呈簇狀生長，細胞簇之間有明顯的界限，貼壁細胞展開生長呈梭形、紡錘性或多角形，細胞質少，胞核增大。10天左右細胞繼續(xù)增殖，呈長梭形，細胞之間相互融合，細胞簇體積增大并相連成片，細胞間隙變小。2MDSCs傳代細胞的生長曲線 生長曲線呈現S形，經過滯留期、對數生長期和平臺期。培養(yǎng)2天內細胞分裂擴增不明顯，生長速度較慢；3天后細胞擴增明顯，生長速度加快，進入對數生長期；6天后細胞增殖受到抑制，生長變慢，進入平臺期。傳第一代細胞增殖速度快于傳四代和七代細胞，同時隨傳代次數增多，細胞增殖速度逐漸下降。3不同接種密度對MDSCs生長的影響 在一定細胞數范圍內，吸光度數值與細胞數成正比。在1×10~6個/ml密度接種時吸光度值最大，細胞數量最多，活性較好，有利于細胞的生長和傳代培養(yǎng)。4MDSCs的鑒定 MDSCs對Desmin和Sca-1免疫細胞化學染色均呈陽性表達，，光鏡下胞膜胞漿呈現棕黃色，成纖維細胞呈陰性反應。PP1~PP6中Desmin的陽性表達率逐漸升高，PP6中兩者陽性表達率均在90%以上。MDSCs傳一代、四代和七代的細胞中均對Desmin和Sca-1均呈陽性表達，表達率均在80%以上。 結論： 通過改良混合酶消化法和差速貼壁技術（preplate），可以獲得新生SD大鼠的MDSCs，傳三代內的MDSCs分裂增殖顯著，細胞活性較好，生長速度較快，在合適的接種密度和培養(yǎng)條件中細胞分裂增殖最好，可獲得較多數目的細胞，Desmin和Sca-1可以鑒定MDSCs，傳至第七代的細胞仍保持較高的活性。
【關鍵詞】：肌源性干細胞 差速貼壁 免疫細胞化學染色 原代培養(yǎng) 生長曲線
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R329
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-11
• 前言11
• 材料與方法11-16
• 結果16-19
• 附圖19-28
• 附表28-30
• 討論30-35
• 結論35
• 參考文獻35-38
• 綜述 骨骼肌肌源干細胞的特性及應用的研究進展38-50
• 參考文獻46-50
• 致謝50-51
• 個人簡歷51

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前3條

1 施向挺;劉穎;華詠;陳衛(wèi)華;王躍閩;;大鼠腓腸肌肌源細胞的培養(yǎng)與鑒定[J];同濟大學學報(醫(yī)學版);2009年02期

2 葉錦;靳風爍;陳錦;王鵬;梁培禾;聶志林;李黔生;;大鼠肌源性干細胞的分離、純化和培養(yǎng)[J];中國組織工程研究與臨床康復;2010年14期

3 丁維進;唐乙;宋艷玲;蘇志達;李翠;劉安堂;胡霞;江華;;應用改良差速貼壁法和有限稀釋技術分離培養(yǎng)小鼠來源肌源干細胞[J];中國組織工程研究與臨床康復;2011年36期

本文編號：674812