本文關鍵詞：人類博卡病毒-1型啟動子分析及非結構蛋白NS1反式作用的研究

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【摘要】：人類博卡病毒-1(Human bocavirus1, HBoV1)歸類于細小病毒科,細小病毒亞科,博卡病毒屬。基因組全長約5.5kb,含左端唯一啟動子,編碼兩個非結構蛋白NS1(nonstructural protein)和NP1(nuclear phosphoprotein),兩個結構蛋白VP1(vira1structural protein1)與VP2(viral structural protein2)。NP1是博卡病毒的特有蛋白,對其研究已經(jīng)取得一定的進展,如存在一個非典型的核定位信號,調(diào)節(jié)炎癥因子的表達,誘導細胞凋亡等等。但作為在病毒感染細胞后最先被轉錄和翻譯且對其基因組復制必須的非結構蛋白NS1,卻研究甚少。 本課題對我們前期研究中分離到的武漢HBoV1病毒株(pWHL-1NCBI GeneB ank:GU139423)的啟動子及NS1進行了初步研究。將全長252nt的啟動子截短突變,運用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測各截短突變的表達活性。結果顯示,在96-145nt內(nèi)有一些可能的轉錄因子結合位點,對啟動子的活性有重要的影響,而146-196nt為啟動子的核心區(qū)域。對96-145nt內(nèi)的部分核心元件進行點突變后,發(fā)現(xiàn)CAAT-box的突變會導致啟動子的活性顯著降低,而TATA-box及CREB、CdxA兩個可能的轉錄因子結合位點的突變對其活性卻無顯著影響。同樣運用雙熒光素酶報告系統(tǒng)探究了HBoV1的NS1對自身啟動子及轉錄因子AP-1、NF-κB、STAT3和GAS啟動子的正調(diào)控活性,發(fā)現(xiàn)NS1的274-379aa為反式作用的關鍵性區(qū)域,AP-1、NF-κB、STAT3啟動子受NS1的調(diào)控,對GAS啟動子活性并無顯著影響。并將NS1基因全長及截短克隆到pEGFP-N1載體中,研究其在細胞內(nèi)的定位,證實在180-274aa內(nèi)有入核信號(NuclearImport Signal, NLS),340-562aa內(nèi)有核輸出信號(Nuclear Export Signal, NES)。 HBoV1啟動子的分析、NS1對自身啟動子正調(diào)控活性及NS1在細胞內(nèi)定位的研究結果,為病毒蛋白的表達及其復制機制提供了參考數(shù)據(jù)；并首次發(fā)現(xiàn)NS1對NF-κB、AP-1、STAT3這幾種涉及炎癥反應的主要轉錄因子啟動子具有正調(diào)控作用,揭示了NS1可能與HBoVl的致病性有關,為進一步研究HBoV1致病的分子機制提供了參考。
【關鍵詞】：HBoV1 啟動子 NS1 反式作用 正調(diào)控 細胞內(nèi)定位
【學位授予單位】：華中師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R373
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-11
• 第一章 前言11-19
• 1.1 病毒結構11-13
• 1.2 流行病學13
• 1.3 混合感染13-14
• 1.4 傳播14
• 1.5 感染靶標器官和發(fā)病機理14-15
• 1.6 持續(xù)感染15
• 1.7 診斷15-16
• 1.8 風險因素16
• 1.9 治療16-17
• 1.10 小結17
• 1.11 PEGFP真核表達系統(tǒng)17-18
• 1.12 雙熒光素酶報告系統(tǒng)18-19
• 第二章 實驗材料19-23
• 2.1 載體、菌株與細胞系19
• 2.2 試劑19
• 2.3 實驗所需各種抗生素19-20
• 2.4 實驗用各種溶液20-21
• 2.4.1 LB液體培養(yǎng)基20
• 2.4.2 LB固體平板及抗性篩選平板制備20-21
• 2.4.3 DMEM細胞培養(yǎng)基配制21
• 2.4.4 PBS緩沖液配制21
• 2.4.5 胰蛋白酶溶液配制21
• 2.5 引物設計21-23
• 2.5.1 HBoV突變引物設計21-22
• 2.5.2 NS1截短引物設計22-23
• 第三章 實驗方法23-27
• 3.1 HBoV1啟動子及各截短突變表達活性的檢測23
• 3.2 檢測HBoV1啟動子在其它哺乳動物細胞系中的活性23
• 3.3 HBoV1啟動子全長及各截短突變的活性檢測23-24
• 3.4 HBoV1啟動子各點突變的的克隆及活性檢測24-25
• 3.5 NS1對HBoV1啟動子的調(diào)控作用25-26
• 3.6 NS1的亞細胞定位26-27
• 第四章 實驗結果27-42
• 4.1 HBoV1啟動子在哺乳動物細胞中的活性27-28
• 4.2 HBoV1啟動子在293T細胞內(nèi)的高表達活性28-30
• 4.3 HBoV1啟動子關鍵區(qū)域的鑒定分析30-34
• 4.5 NS1蛋白對HBoV1啟動子的反式作用活性34-37
• 4.6 NS1對炎癥相關因子的調(diào)節(jié)37-39
• 4.7 NS1在細胞內(nèi)的定位39-42
• 第五章 結果討論42-44
• 參考文獻44-54
• 碩士期間發(fā)表論文54-55
• 致謝55

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 李京京;孫彬;歐陽錦鳳;陳瑩;韓虎;劉凱于;李毅;;人類博卡病毒HBoV1基因組克隆及啟動子活性分析[J];生物工程學報;2011年06期

2 孫彬;李永淑;董衍明;劉凱于;楊勇波;李毅;;人博卡病毒HBoV1非結構蛋白NP1對細胞轉錄因子的調(diào)控[J];微生物學報;2013年07期

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本文編號：618256