本文關鍵詞：篩選攜帶ROCK2基因siRNA有效片段的慢病毒載體

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【摘要】：目的：篩選能夠顯著抑制自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）陰莖海綿體平滑肌細胞內Rho關聯(lián)含卷曲螺旋蛋白激酶2（Rho-associatedcoiled-coil containing protein kinase2，ROCK2）基因表達的攜帶siRNA的慢病毒載體。方法：1.采用組織塊貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)SHR陰莖海綿體平滑肌細胞。2.靶向大鼠ROCK2基因設計具有基因特異性的小干擾RNA(small interference RNA，siRNA)，，構建其短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA, shRNA)重組慢病毒表達載體。①設計RNAi靶點序列并合成靶序列的Oligo DNA，退火形成雙鏈DNA，與經Hpa I、XhoI進行酶切后的GP-Supersilencing Vector載體連接產生shRNA慢病毒載體。②轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，篩選陽性菌落、擴增后提取質粒，進行DNA測序鑒定。③GP-Supersilencing Vector與三種混合包裝質粒共轉染293T細胞，包裝產生shRNA重組慢病毒。3.隨機將5只SHR陰莖海綿體平滑肌細胞分為6組（每組n=5），每組每個樣本3×104個細胞，分別為：A組（未轉染對照組）、B組（攜帶慢病毒轉染組）、C～F組（分別攜帶靶向ROCK2基因的siRNA1～4號靶點的慢病毒轉染組），以MOI=80轉染SHR陰莖海綿體平滑肌細胞，轉染后48小時熒光顯微鏡下觀察細胞GFP表達情況，并用RT-PCR檢測各組被轉染細胞ROCK2基因mRNA的表達。結果：1.經酶切及基因測序鑒定證實重組慢病毒載體質粒構建成功。2.熒光顯微鏡下觀察各組細胞感染效率均大于50%。3.RT-PCR方法檢測轉染后各組ROCK2mRNA的表達：與A組相比，B組ROCK2基因mRNA的表達無明顯改變（P㧐0.05）；C組、D組、F組SHR陰莖海綿體平滑肌細胞ROCK2基因mRNA的表達較A組極顯著下降（P0.01），抑制效率分別達到43.91±8.19!、47.15±6.64!、25.7±6.03!；E組SHR陰莖海綿體平滑肌細胞ROCK2基因mRNA的表達較A組顯著下降（P0.05），抑制效率為16.81±5.94!。結論：1.本研究成功構建了大鼠ROCK2基因RNAi慢病毒載體，為后續(xù)的改善SHR勃起功能的體內外實驗奠定了基礎。2.構建的4種攜帶ROCK2基因的siRNA慢病毒載體均能夠顯著抑制SHR陰莖海綿體平滑肌細胞內ROCK2基因的表達，其中有3種慢病毒載體抑制作用較強。
【關鍵詞】：SHR大鼠 ROCK2 RNA干擾 靶點篩選
【學位授予單位】：瀘州醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R3416
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 前言9-11
• 材料與方法11-31
• 結果31-39
• 討論39-41
• 結論41-42
• 參考文獻42-45
• 英漢縮略詞對照表45-46
• 致謝46-47
• 綜述47-60
• 參考文獻56-60

【參考文獻】

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本文編號：600435