本文關鍵詞：siRNA靶向抑制肝素生物合成酶NDST-2以揭示肝素在肥大細胞中的天然活性，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：肝素(Heparin, Hep)是由不同硫酸化程度的葡萄糖胺和葡萄糖醛酸／艾杜糖醛酸二糖單位所組成的粘多糖,是目前臨床上最重要的抗凝血和抗血栓藥物。然而,凝血因子FXa和FIIa一直存在于血液中,而Hep則僅由肥大細胞合成、貯存和釋放,只有在受到刺激時才釋放出來。血液持續(xù)在血管中流動而不發(fā)生血栓的原因在于與血液直接接觸的血管內(nèi)皮細胞表面表達有與Hep類似的抗凝物質——硫酸乙酰肝素(Heparan Sulfate, HS)。故Hep在肥大細胞內(nèi)的天然活性并不是抗凝。已有證據(jù)表明,Hep的強電負性使其與肥大細胞顆粒中多種物質的貯存及活性的發(fā)揮密切相關,但這些研究大多是在細胞外、分子水平上進行的。Hep作為肥大細胞顆粒中的重要組成成分,在研究其天然活性時,必需要以肥大細胞為對象來進行。 Hep生物合成是在以N-乙酰葡糖胺和D-普通糖醛酸為雙糖單位聚合的未硫酸化的多糖鏈上逐步完成的,共包括五步反應,第一步是GlcNAc的N-脫乙酰、N-硫酸化。該步反應是Hep生物合成中至關重要的一步反應。N-脫乙酰-N-磺基轉移酶(N-deacetylase/N-sulfotransferase, NDST)-2即為催化該步反應的酶類。理論上來講,抑制該步反應必然會導致Hep生物合成的阻斷,從而使肥大細胞顆粒內(nèi)出現(xiàn)Hep缺失。慢病毒載體是一類重組逆轉錄病毒載體,其優(yōu)點有感染效率高,可有效感染原代細胞和非分裂期細胞,能夠實現(xiàn)攜帶基因片段的穩(wěn)定表達等。 本課題即采用慢病毒載體特異性抑制大鼠腹腔肥大細胞(Rat peritoneal mast cells, RPMC)內(nèi)的NDST-2,制造Hep合成受阻的肥大細胞,考察此時RPMC形態(tài)變化、顆粒內(nèi)介質含量及脫顆粒過程,進而探討Hep在肥大細胞內(nèi)的天然活性。 本課題的研究內(nèi)容及成果主要包括四個文面： 1RPMC的分離及鑒定 提取大鼠腹腔懸液并采用梯度密度離心法分離純化RPMC,經(jīng)阿利新藍-蕃紅染色法、硫酸小檗堿染色法鑒別確定所提細胞主要為RPMC,經(jīng)流式細胞術檢測細胞表面IgE抗體鑒定其純度達88.3%。確立了RPMC的分離方法。 2RPMC的體外長期培養(yǎng) 系統(tǒng)采用不同濃度的干細胞生長因子(Stem cell factor, SCF)、白介素3(Interleukin-3, IL-3)和白介素4(Interleukin-4, IL-4)單獨或聯(lián)合應用體外培養(yǎng)RPMC,分別于第7、14、21天進行阿利新藍-蕃紅染色法觀察其對RPMC存活及Hep表達情況的影響,選擇RPMC長期存活且Hep表達情況最佳的培養(yǎng)條件為模型條件以進行后期實驗。結果顯示SCF是維持RPMC存活的必要條件,目.單獨使用SCF對RPMC中Hep表達最有利。IL-3的使用則會促進RPMC分化,由合成Hep轉為合成硫酸軟骨素(Chondroitin sulfate, CS)。IL-4也有一定促分化作用,但不如IL-3強。 3慢病毒介導抑制RPMC中NDST-2的表達 以陰性對照慢病毒分別在有無聚凝胺的條件下以1、10、50、100感染復數(shù)(Multiplicity of Infection, MOI)感染RPMC,熒光顯微鏡觀察及流式細胞術檢測熒光細胞比例來確定最佳感染條件。以最佳感染條件分別將4種NDST-2慢病毒感染RPMC, western-blot檢測其NDST-2表達情況以篩選最佳干擾序列。結果顯示在5μg/mL polybrene, MOI為100時為最佳感染條件,感染效率可達90%。NDST-24號慢病毒干擾效果最佳,抑制率可達90%以上 4NDST-2抑制后RPMC生物學活性的變化 NDST-24號慢病毒感染RPMC,在第6、12、18天進行阿利新藍-蕃紅染色,觀察NDST-2抑制后Hep表達情況,選擇最佳檢測時間。進行NDST-2抑制后RPMC顆粒內(nèi)介質含量的檢測及脫顆粒介質釋放率的檢測,FM4-64膜熒光染料染色觀察脫顆粒時細胞變化。結果顯示感染第12天為最佳檢測時間,胞內(nèi)Hep表達大幅下降。組胺、類胰蛋白酶含量均有不同程度的下降,β-氨基已糖苷酶含量則無明顯變化。NDST-2干擾組脫顆粒程度較陰性對照組要低。 以上結果表明,Hep在肥大細胞的作用為輔助肥大細胞顆粒貯存組胺、類胰蛋白酶等生物活性物質,且可對肥大細胞脫顆粒程度產(chǎn)生影響。
【關鍵詞】：肝素 肥大細胞 慢病毒干擾 脫顆粒 N-脫乙酰-N-磺基轉移酶-2
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 摘要10-12
• ABSTRACT12-15
• 符號說明15-16
• 第一章 前言16-24
• 1 肝素的結構16-17
• 2 肝素的生物合成過程17-18
• 3 肝素的關鍵生物合成酶18-19
• 3.1 NDSTs18-19
• 3.2 另外四種肝素生物合成關鍵酶19
• 4 肝素與肥大細胞亞型19-20
• 5 肥大細胞中肝素作用的初步研究20-21
• 6 慢病毒載體介導的RNAi技術簡介21-22
• 7 本課題的研究內(nèi)容22-24
• 第二章 大鼠腹腔肥大細胞的分離與鑒定24-31
• 1 材料24-25
• 1.1 試劑24
• 1.2 動物24
• 1.3 儀器24-25
• 2 方法25-27
• 2.1 溶液配制25
• 2.2 RPMC提取25-26
• 2.3 阿利新藍-蕃紅染色法鑒別RPMC26
• 2.4 硫酸小檗堿染色法鑒別RPMC26-27
• 2.5 流式細胞術間標法鑒定RPMC純度27
• 3 結果27-29
• 3.1 RPMC提取27
• 3.2 阿利新藍-蕃紅染色法鑒別RPMC27-28
• 3.3 硫酸小檗堿染色法鑒別RPMC28-29
• 3.4 流式細胞術間標法鑒定RPMC純度29
• 4 討論29-31
• 第三章 RPMC體外長期培養(yǎng)31-43
• 1 材料31-32
• 1.1 試劑31-32
• 1.2 動物32
• 1.3 儀器32
• 2 方法32-34
• 2.1 溶液配制32
• 2.2 RPMC提取32
• 2.3 RPMC培養(yǎng)32-33
• 2.4 阿利新藍-蕃紅染色33-34
• 3 結果34-40
• 3.1 培養(yǎng)第7天阿利新藍-蕃紅染色34-37
• 3.2 培養(yǎng)第14天阿利新藍-蕃紅染色37-39
• 3.3 培養(yǎng)第21天阿利新監(jiān)-蕃紅染色39-40
• 4 討論40-43
• 第四章 慢病毒介導抑制RPMC中NDST-2表達43-57
• 1 材料43-44
• 1.1 試劑43-44
• 1.2 動物44
• 1.3 儀器44
• 2 方法44-49
• 2.1 溶液配制44-46
• 2.2 慢病毒最佳感染條件的確定46
• 2.3 嘌呤霉素RPMC細胞最低至死濃度篩選46
• 2.4 Western Blot篩選最佳干擾序列46-49
• 3 結果49-55
• 3.1 慢病毒在RPMC中最佳感染條件的確定49-54
• 3.2 嘌呤霉素RPMC細胞最低至死濃度54
• 3.3 Western Blot篩選最佳干擾序列54-55
• 4 討論55-57
• 第五章 NDST-2抑制后RPMC形態(tài)及脫顆粒功能的變化57-70
• 1 材料57-58
• 1.1 試劑57-58
• 1.2 動物58
• 1.3 儀器58
• 2 方法58-60
• 2.1 溶液配制58-59
• 2.2 阿利新藍-蕃紅染色觀察RPMC中肝素含量及細胞形態(tài)變化59
• 2.3 慢病毒干擾NDS-2合成后RPMC脫顆粒介質的檢測59-60
• 2.4 熒光觀察慢病毒于擾NDS-2后RPMC脫顆粒過程60
• 3 結果60-66
• 3.1 阿利新藍-蕃紅染色觀察干擾后的RPMC61-62
• 3.2 慢病毒干擾后脫顆粒介質的檢測62-64
• 3.3 熒光觀察慢病毒干擾后RPMC脫顆粒過程64-66
• 4 討論66-70
• 4.1 阿利新藍-蕃紅染色觀察干擾后的RPMC66-67
• 4.2 NDST-2干擾后RPMC胞內(nèi)介質含量的變化67-68
• 4.3 NDST-2干擾后RPMC脫顆粒反應的變化68-70
• 總結70-71
• 參考文獻71-76
• 致謝76-77
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表的學術論文77-78
• 學位論文評閱及答辯情況表78

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 何韶衡;肝素對人肥大細胞組胺分泌的調(diào)節(jié)作用[J];免疫學雜志;2004年06期

  本文關鍵詞：siRNA靶向抑制肝素生物合成酶NDST-2以揭示肝素在肥大細胞中的天然活性，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：436249