發(fā)布時間：2017-06-06 02:09

  本文關(guān)鍵詞：輪狀病毒與腸道病毒71型的重組嵌合基因工程疫苗初步研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：人輪狀病毒(Human Rotavirus, RV),是引起嬰幼兒腹瀉的主要病原體之一,其主要感染小腸上皮細胞,從而造成細胞損傷,引起腹瀉。輪狀病毒每年在夏秋冬季節(jié)流行,并在世界范圍內(nèi)造成大量嬰幼兒死亡病例。目前尚無針對輪狀病毒引起的腹瀉的有效治療手段,因而采用疫苗預(yù)防嬰幼兒感染是目前的主要手段。目前國內(nèi)外的上市輪狀病毒疫苗均為減毒輪狀病毒疫苗,在預(yù)防RV的感染過程中發(fā)揮了一定的作用,但也存在引發(fā)腸套疊、毒力返祖及外源因子污染等問題。腸道病毒71型(Human Enteroirus71, EV71), EV71是引起嬰幼兒手足口病(Hand-Foot And Mouth Disease, HFMD)的主要病原體之一,多發(fā)生于5歲以下兒童,可引起手、足、口腔等部位的皰疹,少數(shù)患兒可引起心肌炎、肺水腫、無菌性腦膜炎等并發(fā)癥甚至導(dǎo)致死亡。EV71滅活疫苗的研發(fā)過程中,存在著高保護效力高遺傳穩(wěn)定性毒株篩選等問題,目前國內(nèi)外有數(shù)個EV71滅活疫苗項目正在進行臨床試驗。EV71減毒活疫苗的研發(fā)過程中出現(xiàn)遺傳不穩(wěn)定及引發(fā)個別并發(fā)癥問題。綜上,本實驗擬通過構(gòu)建同時包含RV及EV71主要抗原表位的亞單位疫苗,并通過免疫刺激最終對RV及EV71起到一定的保護作用。 輪狀病毒VP4蛋白作為輪狀病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白,決定輪狀病毒的血清P型,主要具有與細胞受體結(jié)合并穿透細胞、血凝反應(yīng)等功能,并能決定輪狀病毒的毒力,引起較強的中和反應(yīng)。VP4或其亞片段能刺激有效的免疫反應(yīng)產(chǎn)生,因而VP4特別適合用于亞單位疫苗的研究。該蛋白在胰蛋白酶的作用下可裂解為VP5和VP8兩個肽段。目前主要鑒定出的VP4中和抗原表位肽大都集中在氨基端的VP8肽段。EV71基因組為單股正鏈RNA,基因組全長約7500bp,編碼一個開放閱讀框,翻譯約2200個氨基酸的前體蛋白,前體蛋白可水解為VP1、VP2、VP3、VP4四個結(jié)構(gòu)蛋白并包裝病毒顆粒,其中除VP4位于病毒顆粒內(nèi)側(cè)外,VP1-3三個結(jié)構(gòu)蛋白均暴露于病毒顆粒表面,EV71VP1蛋白作為EV71的結(jié)構(gòu)蛋白,具有EV71主要的抗原決定簇,是病毒主要的中和決定因子�；谳啝畈《炯澳c道病毒71型的以上特點,結(jié)合文獻、蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)、親疏水性與抗原表位分布的軟件分析預(yù)測,本實驗選取約800bp左右包括VP8全長與VP5部分片段的基因片段的VP4*片段及EV71VP1全長用于重組嵌合蛋白的構(gòu)建。 本實驗共設(shè)計RV VP4*、EV71VP1、RV VP4*-EV71VP1、EV71VP1-RV VP4*四個實驗組,結(jié)合分析軟件結(jié)果,預(yù)期RV VP4*-EV71VP1實驗組能保持較穩(wěn)定的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)并起到較好的免疫效果。 前期大腸桿菌BL21株pET20b/30a/pthio原核表達實驗結(jié)果提示,通過原核表達途徑不能夠較好的獲得預(yù)期的四個實驗組蛋白,結(jié)合文獻資料與實驗分析推測原因如下：1、RV VP4*蛋白具有細胞毒性,會阻礙大腸桿菌的正常表達和生長,2、選取的原核表達系統(tǒng)缺少這兩個蛋白的個別稀有密碼子,3、mRNA高級結(jié)構(gòu)或會阻礙目的蛋白的翻譯。鑒于重新選取目的基因片段的難度和時間問題,故決定采用腺病毒表達系統(tǒng)構(gòu)建包含目的蛋白的重組腺病毒。 后期實驗包裝并獲得了具有RV VP4*、EV71VP1、RV VP4*-EV71VP1、EV71VP1-RV VP4*目的蛋白片段的四個重組腺病毒,感染重組腺病毒的細胞總RNA RT-PCR實驗結(jié)果及免疫熒光實驗證明,四個重組腺病毒均能較好的轉(zhuǎn)錄和翻譯目的基因。經(jīng)過傳代獲得初步純化的重組腺病毒并進行了動物實驗,動物實驗結(jié)果表明,四個重組腺病毒均能刺激機體產(chǎn)生相對應(yīng)的特異性抗體。目前實驗未能發(fā)現(xiàn)含有目的基因的重組腺病毒所刺激產(chǎn)生的抗血清具有對EV71及RV的保護作用,推測因為免疫試驗動物的病毒滴度不高及實驗重復(fù)次數(shù)較少等原因造成,因此含有目的基因的重組腺病毒對于EV71及RV的中和保護作用尚不能定論,需做進一步的研究。在比較兩種表達系統(tǒng)優(yōu)異性及分析比對多個動物實驗數(shù)據(jù)組的過程中,為未來的輪狀病毒及腸道病毒71型基因工程聯(lián)合疫苗研發(fā)工作提供了一定啟示和思路。
【關(guān)鍵詞】：輪狀病毒 EV71 重組嵌合
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-10
• 前言10-14
• 第一部分 原核表達RV與EV71的重組嵌合基因工程疫苗初步研究14-30
• 實驗材料與方法14-22
• 實驗材料14-15
• 實驗方法15-22
• 結(jié)果與分析22-27
• 討論27-29
• 小結(jié)29-30
• 第二部分 RV與EV71嵌合基因在重組藤病毒系統(tǒng)中的表達及免疫學(xué)評價30-59
• 實驗材料與方法30-44
• 實驗材料30-32
• 實驗方法32-44
• 結(jié)果與分析44-57
• 討論57-58
• 小結(jié)58-59
• 參考文獻59-62
• 附錄62-70
• 縮略詞62-63
• 主要溶液配方63-65
• 測序結(jié)果65-70
• 文獻綜述70-75
• 參考文獻73-75
• 致謝75

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 陳元鼎,劉名英,鄒永健,彭梅,戴長柏,FranciscoE．Baralle;表達輪狀病毒SA11株Vp4的抗原表位誘導(dǎo)病毒中和抗體生成[J];中國病毒學(xué);1997年02期

  本文關(guān)鍵詞：輪狀病毒與腸道病毒71型的重組嵌合基因工程疫苗初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：425135