發(fā)布時(shí)間：2017-06-03 18:03

  本文關(guān)鍵詞：雜合抗菌肽Cecropin P1-Dermaseptin S4在畢赤酵母中的分泌表達(dá)及活性檢測(cè)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的： 將兩種抗菌肽優(yōu)化后的基因片段進(jìn)行拼接，通過(guò)構(gòu)建攜帶融合基因的表達(dá)載體pPICZαA-cp1-ds4并在畢赤酵母X-33中高效分泌表達(dá)，并研究雜合抗菌肽Cecropinp1-Dermaseptin S4的抗菌活性、穩(wěn)定性及抗腫瘤活性。 方法： 1．將兩種抗菌肽氨基酸序列組合在一起利用Antheprot release5.0預(yù)測(cè)雜合抗菌肽Cecropin P1-Dermaseptin S4的二級(jí)結(jié)構(gòu)，利用The antimicrobial peptidesdatabases(APD)預(yù)測(cè)雜合抗菌肽的理化性質(zhì)及成為抗菌肽的可能性。 2.抗菌肽Dermaseptin S4基因的克�。焊鶕�(jù)畢赤酵母的密碼子偏愛(ài)性和Genbank中Dermaseptin S4的氨基酸序列以及部分Cecropin P1C-末端的部分氨基酸序列，設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)钠唇右锿ㄟ^(guò)重疊延伸PCR（SOE-PCR）進(jìn)行拼接，將拼接產(chǎn)物克隆至pMD18-T載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后測(cè)序。 3.雜合抗菌肽基因的克�。悍謩e以保存Cecropin P1和Dermaseptin S4正確序列的pPICZαA-cp1和pMD18T-ds4質(zhì)粒為模板，以各自特異性引物為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后通過(guò)SOE-PCR拼接兩基因片段，，將拼接片段克隆至pMD18-T載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后測(cè)序。 4.表達(dá)載體pPICZα-cp1-ds4的構(gòu)建：重組質(zhì)粒pMD18T-cp1-ds4和表達(dá)載體pPICZα-A分別經(jīng)EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切后利用T4DNA連接酶進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后測(cè)序。 5.重組酵母菌pPICαA-cp1-ds4/X-33的構(gòu)建：將表達(dá)載體pMD18T-cp1-ds4經(jīng)Sac I線(xiàn)性化后，采用EMC830電穿孔儀低電壓模式電轉(zhuǎn)化酵母并利用100mg/L Zeocin進(jìn)行篩選。 6.重組子誘導(dǎo)表達(dá)及初步活性檢測(cè)：采用BMGY和BMMY誘導(dǎo)培養(yǎng)基以0.5%（v/v）甲醇濃度進(jìn)行培養(yǎng)，利用Tricine-SDS-PAGE檢測(cè)目的多肽的表達(dá)并采用瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)濃縮上清中雜合抗菌肽Cecropin P1-Dermaseptin S4的抗菌活性。 7.表達(dá)產(chǎn)物的純化：通過(guò)提高Zeocin的濃度篩選多拷貝酵母重組子，利用BMGY和BMMY誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)并采用AKTA蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行純化。 8.抗菌譜及最小抑菌濃度測(cè)定：分別采用瓊脂擴(kuò)散法和微量稀釋法測(cè)定雜合抗菌肽Cecropin P1-Dermaseptin S4的抗菌譜及最小抑菌濃度。 9.采用Hultmark等通過(guò)計(jì)算抗菌活力來(lái)表征抗菌肽的抑菌能力的方法衡量雜合抗菌肽Cecropin P1-Dermaseptin S4的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性及胰酶消化穩(wěn)定性。 10.采用MTT法來(lái)研究雜合抗菌肽Cecropin P1-Dermaseptin S4作用于小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0的效果。 結(jié)果： 1.經(jīng)Antheprot release5.0預(yù)測(cè)雜合抗菌肽Cecropin P1-Dermaseptin S4的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)雜合多肽依然能夠保持N-末端和C-末端為雙螺旋結(jié)構(gòu)，兩螺旋結(jié)構(gòu)之間存在疏松了連接片段，經(jīng)APD預(yù)測(cè)雜合抗菌肽有成為抗菌肽的可能。 2.經(jīng)SOE-PCR成功將拼接引物拼接成Dermaseptin S4基因，大小約120bp，將其克隆至pMD18-T載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α并測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示序列與設(shè)計(jì)序列一致。 3.經(jīng)SOE-PCR成功將Cecropin P1和Dermaseptin S4基因片段拼接后，將其克隆至pMD18-T載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α并測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示序列與設(shè)計(jì)序列一致。 4. pMD18T-cp1-ds4和表達(dá)載體pPICZα-A經(jīng)雙酶切、酶連反應(yīng)后，重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α并測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示開(kāi)放閱讀框完全正確，所編碼的氨基酸序列與設(shè)計(jì)一致。 5.表達(dá)載體pPICαA-cp1-ds4經(jīng)Sac I線(xiàn)性化后在ECM830低電壓模式（電壓為350V，脈沖時(shí)間15s，脈沖次數(shù)1次）下可成功電轉(zhuǎn)化畢赤酵母X-33，用Zeocin篩選得到陽(yáng)性重組子。 6.瓊脂擴(kuò)散法初步檢測(cè)對(duì)大腸埃希菌和經(jīng)黃色葡萄球菌的作用效果，加入濃縮表達(dá)上清均有抑菌環(huán)形成。 7.提高Zeocin濃度篩選多拷貝重組子，結(jié)果得到的菌株對(duì)Zeocin最大的耐受濃度為400mg/L，用多拷貝重組子表達(dá)目的多肽其產(chǎn)量約為30mg/L，經(jīng)AKTA蛋白純化系統(tǒng)純化后可得一特異性蛋白條帶。 8.抗菌譜測(cè)定實(shí)驗(yàn)中對(duì)選取的大腸桿菌DH5α、金黃色葡萄球菌、嗜酸乳桿菌、枯草芽孢桿菌、志賀氏菌SDCDC563、鼠傷寒沙門(mén)氏菌CMCC50222均有抑制作用其最小抑菌濃度分別約為37.5μg/ml、75ug/ml、75ug/ml、150ug/ml、150ug/ml、150ug/ml，對(duì)銅綠假單孢菌27853無(wú)效。 9.對(duì)雜合抗菌肽進(jìn)行熱、酸堿和胰酶消化后仍能保持較高的抑菌活力。 10.通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)，雜合抗菌肽對(duì)小鼠骨髓瘤細(xì)胞存在抑制作用。 結(jié)論： 能夠利用基因工程手段成功分泌表達(dá)雜合抗菌肽Cecropin P1-Dermaseptin S4，研究結(jié)果表明該雜合肽對(duì)多種革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌表現(xiàn)出抑菌作用，該雜合抗菌肽具有較好的熱、酸堿和抗胰酶消化穩(wěn)定性；對(duì)小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0有一定的抑制效果。
【關(guān)鍵詞】：雜合抗菌肽 Cecropin P1 Dermaseptin S4 分泌表達(dá) 生物活性
【學(xué)位授予單位】：濟(jì)南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R3416
【目錄】：

• 研究生導(dǎo)師及課題指導(dǎo)小組簡(jiǎn)介5-7
• 摘要7-10
• Abstract10-14
• 主要符號(hào)14-16
• 第一章 前言16-24
• 1.1 抗菌肽概述16-17
• 1.2 抗菌肽分類(lèi)17-18
• 1.3 抗菌肽作用機(jī)制18-20
• 1.4 應(yīng)用及展望20-21
• 1.5 Cecropin P1 研究現(xiàn)狀21
• 1.6 Dermaseptin S4 研究現(xiàn)狀21-22
• 1.7 課題創(chuàng)新點(diǎn)及研究意義22-24
• 第二章 雜合抗菌肽 Cecropin P1-Dermaseptin S4 在畢赤酵母中的誘導(dǎo)表達(dá)24-48
• 2.1 材料與方法24-37
• 2.2 結(jié)果37-45
• 2.3 討論45-48
• 第三章 雜合抗菌肽 CecropinP1-DermaseptinS4 的純化及抗菌作用研究48-60
• 3.1 材料與方法48-53
• 3.2 結(jié)果53-58
• 3.3 討論58-60
• 第四章 雜合抗菌肽 Cecropin P1-Dermaseptin S4 作用于小鼠骨髓瘤細(xì)胞 SP2/0 的效果研究60-64
• 4.1 材料和方法60-62
• 4.2 結(jié)果62-63
• 4.3 討論63-64
• 結(jié)論64-65
• 參考文獻(xiàn)65-71
• 附錄71-78
• 綜述78-90
• 參考文獻(xiàn)86-90
• 攻讀學(xué)位期間取得的研究成果90-91
• 致謝91

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：雜合抗菌肽Cecropin P1-Dermaseptin S4在畢赤酵母中的分泌表達(dá)及活性檢測(cè)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：418818