本文關鍵詞：在α地中海貧血伴智力低下綜合征家系中鑒定一種ATRX基因新突變，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景與目的 α地中海貧血伴智力低下綜合征,又稱ATR-X綜合征(X-linked alpha thalassemia mental retardation syndrome, MIM#301040)是一種罕見的X連鎖的顯性遺傳復雜性的綜合征,其臨床特征主要包括：智力發(fā)育障礙,生長發(fā)育遲緩,特征性面容,伴有輕度a-地中海貧血,該病在男性患者的發(fā)病率小于1-9/100,000。致病基因定位于Xq21.1,為編碼2492個氨基酸的ATRX基因,到目前為止,全世界已有125種該基因的突變報道,這些突變主要集中位于ATRX氮端的PHD鋅指結構域和碳端的螺旋霉結構域中。此外,ATRX還與HP1alpha (heterochromatin protein1alpha), DAXX, MEPC2, and promyelocytic leukemia PML) nuclear bodies等多種蛋白相互作用,ATRX基因的異常,還涉及到以下綜合征：Juberg-Marsidi綜合征(OMIM#309590), Smith-Fineman-Myers綜合征(OMIM#309580), Carpenter-Waziri綜合征,嚴重智力低下伴痙攣性麻痹以及Holmes-Gang綜合征。這些研究結果都暗示了ATRX基因的突變,可以引起廣泛的臨床表型,然而目前對于ATRX基因型和表型的關系沒有準確的定義,臨床上的很多現(xiàn)象很難去解釋。本文研究一個ATR-X綜合征家系,對家系中患者進行詳細的臨床診斷及全面的分子遺傳學機制研究,并期發(fā)現(xiàn)新的基因或新突變。 材料與方法 1.材料：臨床收集到一個ATR-X綜合征家系,病人是兩個兄弟來自于一個健康的、非近親通婚的家族。父母的第一個孩子足月產(chǎn),6歲死于肝癌,這對夫婦的第二、第四、第五胎小孩均不明原因流產(chǎn)。并對家系人員詢問病史,進行全面系統(tǒng)的臨床診斷及輔助檢查。兩兄弟具有如下共同臨床特征：(1)生長發(fā)育遲緩；(2)智力低下,智力(IQ)檢測為25分以下；(3)語言表達嚴重障礙；語言理解能力差；(4)癡呆面容,反應遲鈍,經(jīng)常發(fā)笑和叫喊,注意力不集中；(5)肌張力減退,四肢感覺神經(jīng)敏感性減低；經(jīng)常被無意中碰傷和凍傷；(6)不能獨立站立和行走,攙扶站立時腳尖著地,生活不能自理；(7)牙齒發(fā)育不良,經(jīng)常流涎；(8)大小便失禁。輔助檢查結果：(1)核型分析,46,XY；(2)頭部CT提示輕度腦萎縮；(3)血紅蛋白HbH包涵體實驗陽性,兩兄弟包涵體含量分別為6%和7%。弟弟聽性腦干反應(ABR)檢查提示神經(jīng)傳導障礙。 2.方法：簽訂知情同意書后,繪制家系圖,采集了家系中所有成員靜脈血并提取了DNA。(1)對兩名患者進行全基因組外顯子測序。a.將DNA隨機打斷成100-200bp的片段；b.使用Illumina Paired-End Genomic DNA Sample Prep試劑盒按照說明,并通過Hiseq2000進行測序；c.結果通過SAMtools軟件進行過濾；d.參照dbSNP131,1000Genome Project (20100804release)和YH database公共數(shù)據(jù)庫過濾掉已發(fā)表的正常對照個體的突變；e.對兩名患者的突變集合中取交集。優(yōu)先在ATRX基因尋找是否存在突變。(2)對患者及父母進行了全基因組拷貝數(shù)的分析,使用Array-CGH的方法。(3)對外顯子測序發(fā)現(xiàn)的突變位點,在其兩端設計引物進行PCR擴展后,通過sanger測序的方法在家系中進行驗證。(4)之后在更大范圍的正常人群中用DHPLC的方法進一步驗證。(5)利用I-TASSER軟件進行同源建模,以觀察突變位點對結構的影響。 結果與討論 全面系統(tǒng)的臨床分析可以確診兩患者為ATR-X綜合征。(1)外顯子測序結果經(jīng)過濾后,平均檢測出了非同義／剪切位點／缺失和插入突變共45470個,經(jīng)公共數(shù)據(jù)庫過濾后剩下412個非同義/剪切位點/缺失和插入突變,接著對兩集合取交集,由于首先考慮該家系為X連鎖的隱性遺傳,我們又在交集中進一步過濾掉了常染色體及Y染色體上的SNPs,最終候選的位點剩下84個；(2)我們優(yōu)先挑選了ATRX基因上的突變進行驗證,因為該基因為已報道的ATR-X綜合征的致病基因。外顯子測序結果顯示在ATRX基因編碼區(qū)內(nèi)有c.3773TA的突變；(3)經(jīng)過PCR擴增測序驗證發(fā)現(xiàn)該突變同時存在于兩患者中,遺傳自母親。突變c.3772TA導致谷氨酸替代了結氨酸(V1258E),該位點在多個物種中顯示高度的保守性。隨后在200個正常人樣本中的驗證并沒有發(fā)現(xiàn)有這種突變。(4)使用I-TASSER生物軟件模擬突變前后的變化,結果顯示由于谷氨酸的替代,使得此區(qū)域的電荷和極性發(fā)生了改變,從而影響了與該區(qū)域作用的DAXX蛋白綁定位點特異性發(fā)生了改變。(5)Array-CGH在全基因組下并沒有掃描到與智力低下有關拷貝數(shù)的變異。 通過對患病兩兄弟進行了全面系統(tǒng)的診斷及輔助檢查,檢測出患者具有嚴重的智力功能障礙,生長發(fā)育遲緩,肌張力減退及特征性面容,輔助檢查血紅蛋白HbH包涵體實驗陽性的結果也進一步支持了診斷,接著通過翻閱文獻對比臨床特征之后,我們確定兩患者為α-地中海貧血伴智力低下綜合征患者。ATRX基因作為該綜合征的候選基因,其位于X染色體上,包含的兩個功能區(qū)域主要涉及到DNA的重塑、修復及轉錄的調節(jié)。這樣的功能主要體現(xiàn)在基因組的一些大的重復序列上,比如核糖體DNA、異染色質和端粒。在許多種類的動物實驗中,ATRX基因的異常所表達出了各式各樣的表現(xiàn),像骨骼肌肉的異常和各種腫瘤的發(fā)生等等。本次研究所收集到的家系兩個患者均表現(xiàn)出了典型的ATR-X綜合征的臨床表型,同時也存在著個體的差異,弟弟的臉部特征要略輕于哥哥,并伴有神經(jīng)性耳聾這個哥哥沒有的臨床表型。目前對于這類疾病基因型和表型的關系研究還很局限,像這種同一突變下的表型差異也是很多報道,大多猜測集中在環(huán)境因素,伴隨其他的基因突變和表觀遺傳因子等因素調節(jié)。然而最近針對ATR-X綜合征中α-地中海貧血程度的一些研究表明,ATRX.基因作用在大量的重復序列上影響的基因的表達,即在同一突變下ATRX基因所作用的重復序列越長,其與重復序列相關的基因的表達量越低,表型也就越重。這樣的結果雖然沒有直接的去解釋兩患者的表型差異,但是也從一個側面去證明了這種現(xiàn)象存在的可能于重復序列的長短變化有關。 目前為止,ATRX基因報道了123個不同的突變,主要集中在前后兩端的功能區(qū)。而我們所發(fā)現(xiàn)的突變,位于第10號外顯子而非主要報道的功能區(qū)上,但此區(qū)域包含一個與DAXX相互作用的亞基。隨后用I-TASSER進行同源建模分析了突變前后結構的變化,結構發(fā)現(xiàn)突變位點位于高保守性的區(qū)域,由于氨基酸的替換改變了DAXX亞基綁定位點的特異性,從而影響了ATRX-DAXX復合體的形成。而該復合體主要與染色質重塑有關,ATRX作用在重復序列上抑制著相關基因的表達,當通過與DAXX相互作用使得組蛋白H3.3的聚集,從而達到染色體的重塑,重新激活基因的表達。本研究通過外顯子測序發(fā)現(xiàn)該位點的突變(c.3773TA),軟件模擬突變影響了ATRX-DAXX復合體的形成,從而導致了疾病的發(fā)生,豐富了ATRX基因突變的數(shù)據(jù)庫。
【關鍵詞】：ATR-X綜合征 ATRX基因 HbH包涵體 外顯子測序
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R556.61;R596;R3411
【目錄】：

• 摘要3-7
• ABSTRACT7-14
• 第一章 引言14-18
• 第二章 材料與方法18-37
• 2.1 研究對象和方法18-19
• 2.2 家系病例研究19-21
• 2.3 血紅蛋白HbH包涵體實驗21
• 2.4 細胞遺傳學分析21-24
• 2.5 細胞基因組DNA提取與保存24-26
• 2.6 基因拷貝數(shù)分析—微陣列比較基因組雜交(Array-CGH)26-27
• 2.7 全基因組外顯子測序27-31
• 2.8 Sanger測序驗證31-33
• 2.9 DHPLC在200個正常樣本中對照檢測33-34
• 2.10 蛋白結構預測34-37
• 第三章 結果37-64
• 3.1 調查和研究結果及分析37-44
• 3.2 實驗室檢查44-54
• 3.3 分子遺傳學檢測54-64
• 第四章 討論64-76
• 4.1 患者的臨床特征及其病因學分析64-68
• 4.2 無癥狀攜帶者的原因分析68-69
• 4.3 下一步工作計劃69-76
• 第五章 結論76-77
• 參考文獻77-81
• 中英文對照縮略詞表81-84
• 成果84-85
• 致謝85-87

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