本文關(guān)鍵詞：中華按蚊kdr基因突變檢測方法的建立及應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：中華按蚊（Anopheles sinensis）在我國分布廣泛，是間日瘧和馬來絲蟲病傳播的重要媒介。以往的研究發(fā)現(xiàn)中華按蚊具有家、野兩棲且偏嗜吸動物血的習(xí)性，其瘧疾傳播能量較弱。然而最近相關(guān)的文獻報道顯示我國中部地區(qū)的中華按蚊瘧疾傳播能量較上世紀有明顯提升。作為我國中部地區(qū)目前最主要的瘧疾傳播媒介，中華按蚊在當(dāng)?shù)丿懠部刂浦械闹匾匀找媸艿街匾暋?媒介防制是瘧疾控制階段和消除階段的關(guān)鍵措施之一。在我國瘧疾控制階段，主要的媒介防制措施是在瘧疾流行區(qū)大范圍采用殺蟲劑室內(nèi)滯留噴灑或藥物浸泡蚊帳為主的成蚊防制方法。隨著殺蟲劑的廣泛應(yīng)用，昆蟲對殺蟲劑的抗性迅速在全球范圍內(nèi)擴散。昆蟲對殺蟲劑抗性的機制一直是人們關(guān)注的重要問題，越來越多的研究集中于對殺蟲劑抗性機理的研究，昆蟲對殺蟲劑的抗性機制主要有四種：靶標抗性、代謝抗性、行為抗性和表皮化抗性，其中靶標抗性和代謝抗性在昆蟲抗藥性的形成中起著重要作用，即：昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)對殺蟲劑靶位點敏感性的改變和解毒酶表達水平或活性的改變。擊倒抗性（knockdown resistance, kdr）是靶標抗性中的重要代表。一系列的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)擬除蟲菊酯類殺蟲劑的主要作用機理是通過鈉離子通道（voltage gated sodium channel, VGSC）的持續(xù)活化使昆蟲經(jīng)由興奮、痙攣到麻痹而導(dǎo)致昆蟲死亡。鈉離子通道蛋白第二結(jié)構(gòu)域S6區(qū)段編碼的氨基酸序列的改變，即kdr基因L1014位點突變，是引起昆蟲對殺蟲劑抗藥性的關(guān)鍵。 自Kdr基因L1014位點的突變在家蠅、蟑螂等昆蟲中發(fā)現(xiàn)后，又相繼在岡比亞按蚊、庫蚊中發(fā)現(xiàn)其kdr基因L1014位點存在類似的突變。2007年，Kim H等報道鑒定了中華按蚊kdr基因存在L1014F和L1014C突變類型，kdr基因突變后的中華按蚊對擬除蟲菊酯類殺蟲劑的敏感性下降，2011年武松等報道了我國中華按蚊kdr基因也存在L1014F和L1014C突變。 在我國進入瘧疾消除階段后，主要的媒介防制措施是對出現(xiàn)瘧疾病例疫點采用殺蟲劑室內(nèi)滯留噴灑方法來阻斷可能的瘧疾傳播。目前在疫點媒介防制中應(yīng)用最為廣泛的殺蟲劑仍是擬除蟲菊酯類殺蟲劑。而在媒介防制措施中選擇有效的殺蟲劑依賴于對媒介生物抗藥性水平的了解，因此不同地區(qū)的蚊蟲擊倒抗性相關(guān)基因頻率可以為媒介防止措施提供重要的科學(xué)依據(jù)。關(guān)于檢測kdr突變的方法較多，等位基因特異性PCR（AS-PCR）是最早建立的kdr突變檢測方法，該方法具有簡單易于操作的優(yōu)點，但敏感性和特異性較低；SSOP-ELISA、HOLA和PCR-Dot等方法與AS-PCR相比在敏感性和特異性上有一定的提高，但操作步驟繁瑣，耗時長達5～18小時，因此難以在現(xiàn)場媒介監(jiān)測中推廣應(yīng)用。近年來發(fā)展起來的HRM、FRET/MCA、PCR elongation熒光法等也因儀器設(shè)備昂貴或操作繁瑣等原因受到限制。2012年Athanase等報道了AS-LAMP用于檢測岡比亞按蚊kdr的突變，雖然簡單方便省時，但引物設(shè)計困難，而且敏感性和特異性也不盡如人意。上述這些方法主要用于其他蚊種的kdr突變檢測，目前報道的中華按蚊kdr突變檢測方法僅有AS-PCR和rtPASA法，而這兩種方法敏感性和特異性均存在不足，容易漏檢錯檢。 為解決上述問題，本研究擬根據(jù)中華按蚊kdr基因L1014F和L1014C兩種常見突變型，建立了2種新的可用于中華按蚊kdr基因L1014位點突變檢測的實時熒光定量PCR方法，并與經(jīng)典的kdr基因突變檢測方法AS-PCR進行比較，還通過對現(xiàn)場中華按蚊樣本的檢測評估其現(xiàn)場應(yīng)用價值。研究包括四部分： 第一部分 TaqMan-MGB探針實時熒光定量PCR檢測中華按蚊kdr基因突變的研究 方法：根據(jù)文獻報道的中華按蚊鈉離子通道蛋白（VGSC）基因序列（Genbank登錄號：GI84646709）及其L1014位點的常見突變類型，設(shè)計一對實時熒光定量PCR擴增引物和三條TaqMan-MGB探針。用Fast Tissue-to-PCR Kit試劑盒提取的中華按蚊江蘇實驗株樣本gDNA為模板，對反應(yīng)體系中的引物濃度、探針濃度、DNA模板量和反應(yīng)條件進行優(yōu)化。 結(jié)果：采用根據(jù)中華按蚊鈉離子通道（VGSC）基因序列及其L1014位點突變類型設(shè)計的一對引物和三條TaqMan-MGB探針進行實時熒光定量PCR擴增，經(jīng)優(yōu)化后的反應(yīng)體系為：總反應(yīng)體系10μL，其中Thermo Scientific Maxima ProbeqPCR Master Mix（2×）5μL，引物濃度500nmol/L，TaqMan-MGB探針濃度500nmol/L，模板2μL。反應(yīng)條件采用兩步法，即：50℃2min，95℃預(yù)變性10min；95℃變性15s，60℃退火30s，40個循環(huán)；40℃冷卻10s；用優(yōu)化后的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件對突變型和野生型進行單管三重探針檢測，檢測結(jié)果與測序完全一致，但僅能區(qū)分是否發(fā)生突變，不能鑒別具體的突變類型；對六種不同的kdr基因型進行雙管兩重探針檢測，可對具體的突變類型進行鑒別，檢測結(jié)果與測序結(jié)果也完全符合。 第二部分 Allglo探針實時熒光定量PCR檢測中華按蚊kdr基因的研究 方法：根據(jù)文獻報道的中華按蚊鈉離子通道蛋白（VGSC）基因序列（Genbank登錄號：GI84646709）及其L1014位點的常見突變類型，設(shè)計一對實時熒光定量PCR擴增引物和三條Allglo探針。用Fast Tissue-to-PCR Kit試劑盒提取的中華按蚊江蘇實驗株樣本gDNA為模板，對引物濃度、探針濃度、DNA模板量和退火溫度等進行優(yōu)化。 結(jié)果：采用根據(jù)中華按蚊鈉離子通道（VGSC）基因序列及其L1014位點突變類型設(shè)計的一對引物和三條Allglo探針進行實時熒光定量PCR擴增，經(jīng)優(yōu)化后的反應(yīng)體系為：總反應(yīng)體系10μL，其中HR qPCR Probes Master（2×）5μL，引物濃度600nmol/L，Allglo探針濃度600nmol/L，模板2μL。反應(yīng)條件采用兩步法，即：95℃預(yù)變性10min；95℃變性15s，60℃退火30s，40個循環(huán)；40℃冷卻10s。用優(yōu)化后的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件采用單管三重探針法可以對六種不同的kdr基因型進行鑒別，不需要進一步進行雙管兩重探針檢測，檢測結(jié)果與測序結(jié)果完全符合。 第三部分 三種中華按蚊kdr基因突變檢測技術(shù)的比較 方法：用前述建立的TaqMan-MGB探針法和Allglo探針法，與D. Zhong等報道的AS-PCR檢測方法，對163個經(jīng)測序證實的中華按蚊樣本和重組質(zhì)粒標準kdr基因DNA模板進行kdr基因L1014位點突變檢測，評估三種方法的準確性、敏感性，并就成本、耗時等方面進行綜合比較。 結(jié)果：同“金標準”DNA測序相比較，，Allglo探針的準確率最高，錯判和誤判最少，TaqMan-MGB的準確率次之，略低于Allglo探針；AS-PCR的準確率為三者中最差。敏感性的比較結(jié)果顯示TaqMan-MGB探針和Allglo探針均具有比較高的敏感性且兩種方法的敏感性比較接近，AS-PCR的敏感性相對較低。結(jié)合成本和耗時因素分析，“金標準”DNA測序的成本最高，TaqMan-MGB探針檢測法次之，Allglo探針檢測的成本較測序和TaqMan-MGB法有降低，AS-PCR的成本最低，但其準確率也最差。綜合比較分析發(fā)現(xiàn)，Allglo探針法不僅檢測準確率較高，而且成本低、耗時短，因此更適用于現(xiàn)場中華按蚊kdr基因L1014位點突變的檢測。 第四部分 Allglo探針法用于現(xiàn)場中華按蚊kdr基因L1014位點突變的檢測 方法：利用前述已經(jīng)建立的Allglo探針實時熒光定量PCR對從我國中部不同省份不同地點采集的中華按蚊樣本進行kdr基因檢測。并對中華按蚊kdr基因的突變頻率與文獻報道的采集地中華按蚊抗性水平進行初步的比較分析。 結(jié)果：根據(jù)不同省份的中華按蚊kdr基因L1014位點突變的檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)河南、山東、浙江和江蘇等省的中華按蚊kdr基因L1014位點均存在很高的突變頻率。其中河南省的中華按蚊樣本kdr基因突變頻率為90.48%，浙江省的中華按蚊樣本kdr基因突變頻率為97.71%，山東省的中華按蚊樣本kdr基因突變頻率為90.63%，江蘇省的中華按蚊樣本kdr基因突變頻率為87.61%。只有湖北省的中華按蚊樣本kdr基因突變頻率較低為45.38%。這些省份的中華按蚊kdr基因較高的突變率可能與該地區(qū)中華按蚊較高的抗藥性有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：中華按蚊 擬除蟲菊酯 擊倒抗性 突變 熒光定量PCR
【學(xué)位授予單位】：江蘇省血吸蟲病防治研究所
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R384.1
【目錄】：

• 摘要6-10
• Abstract10-15
• 序言15-19
• 第一部分 TaqMan-MGB 探針實時熒光定量 PCR 檢測中華按蚊 kdr基因突變的研究19-35
• 第二部分 Allglo 探針實時熒光定量 PCR 檢測中華按蚊 kdr 基因的研究35-48
• 第三部分 三種中華按蚊 kdr 基因突變檢測技術(shù)的比較48-71
• 第四部分 Allglo 探針法用于現(xiàn)場中華按蚊 kdr 基因 L1014 位點突變的檢測71-77
• 結(jié)論77-78
• 參考文獻78-84
• 致謝84-85
• 綜述85-98
• 參考文獻93-98
• 附錄98-99
• 研究生在讀期間發(fā)表論文99

【參考文獻】

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  本文關(guān)鍵詞：中華按蚊kdr基因突變檢測方法的建立及應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：413743