本文關(guān)鍵詞：人4-1BBL在K562細(xì)胞中的表達(dá)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：4-1BBL（CD137L）為Ⅱ型跨膜糖蛋白分子，屬于腫瘤壞死因子（tumornecrosis factor，TNF）超家族。4-1BBL與其受體4-1BB結(jié)合形成4-1BB/4-1BBL復(fù)合物，作為一對(duì)重要的共刺激分子，廣泛參與多種免疫細(xì)胞的激活。在細(xì)胞免疫過程中，T細(xì)胞增殖分化成效應(yīng)細(xì)胞時(shí)，一方面需要抗原肽-MHC復(fù)合物介導(dǎo)的特異性的刺激，另一方面需要有協(xié)同刺激分子提供的第二信號(hào)。缺乏協(xié)同刺激分子提供第二信號(hào)，T細(xì)胞將進(jìn)入無反應(yīng)狀態(tài)甚至調(diào)亡。因此，協(xié)同刺激分子提供的第二信號(hào)對(duì)于T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答不可或缺。4-1BBL是已知的協(xié)同刺激因子之一，對(duì)其進(jìn)一步的研究對(duì)于了解協(xié)同刺激分子在細(xì)胞免疫中的作用有重要意義。 MICA是一種高度糖基化的跨膜糖蛋白，作為配體與其受體NKG2D結(jié)合在機(jī)體自然免疫中對(duì)NK細(xì)胞的激活起重要作用。NK細(xì)胞表面存在兩種受體：殺傷細(xì)胞抑制性受體和殺傷細(xì)胞活化性受體。抑制性受體特異性識(shí)別細(xì)胞表面MHCⅠ類分子并使得正常的細(xì)胞免遭NK細(xì)胞的殺傷；NK細(xì)胞的活化性受體識(shí)別經(jīng)典、非經(jīng)典MHCⅠ類蛋白分子或MHCⅠ類相關(guān)蛋白分子，在NK細(xì)胞的活化的啟動(dòng)方面起關(guān)鍵作用。NKG2D是NK細(xì)胞重要的活化受體之一，其配基有非經(jīng)典的MHCⅠ類分子蛋白A (MHC classⅠchain-related A，MICA)、 MHCⅠ類分子蛋白B(MHC classⅠ chain related B，MICB)。MICA存在于幾乎所有人類上皮源性腫瘤中，MICA與其受體NKG2D的結(jié)合對(duì)于NK細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞起重要的作用。 克隆并構(gòu)建人4-1BBL和MICA真核表達(dá)質(zhì)粒并進(jìn)行K562細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，對(duì)于進(jìn)一步研究協(xié)同刺激分子在T細(xì)胞免疫中的作用機(jī)理和NK細(xì)胞激活中的免疫機(jī)制具有重要的理論意義，，對(duì)結(jié)合適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中T細(xì)胞免疫和天然免疫系統(tǒng)中NK細(xì)胞在抗病毒感染、抗腫瘤免疫治療中有重要的指導(dǎo)價(jià)值。 本研究主要進(jìn)行以下三方面的工作： 1重組人MICA真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞為材料，提取總RNA為模版進(jìn)行RT-PCR獲得人MICA基因，將其連接到真核表達(dá)載體pcDNA3.1/Hygro中，構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/Hygro-hMICA。對(duì)重組真核表達(dá)質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果進(jìn)行鑒定。 2人4-1BBL真核表達(dá)載體的構(gòu)建 以pORF-h4-1BBL v16為模版進(jìn)行PCR獲得人4-1BBL基因，將其導(dǎo)入雙表達(dá)真核表達(dá)載體pVITRO2-neo-mcs中，構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒pVITRO-h4-1BBL。 3將成功構(gòu)建的重組人真核表達(dá)質(zhì)粒pVITRO2-h4-1BBL用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方式轉(zhuǎn)染到K562細(xì)胞內(nèi)。有限稀釋法篩選陽(yáng)性單克隆。流式細(xì)胞術(shù)鑒定表達(dá)4-1BBL的重組K562細(xì)胞單克隆。 綜上，本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了人真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/Hygro-MICA和人真核表達(dá)質(zhì)粒pVITRO2-h4-1BBL，并將重組真核表達(dá)質(zhì)粒pVITRO2-h4-1BBL轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞，獲得表達(dá)4-1BBL蛋白的重組K562細(xì)胞單克隆。
【關(guān)鍵詞】：4-1BBL MICA K562 轉(zhuǎn)染
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：Q78;R392.12
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 第1章 緒論11-21
• 1.1 MICA 的概述12-15
• 1.1.1 MICA 的基因結(jié)構(gòu)13
• 1.1.2 MICA 分子的表達(dá)調(diào)控13-14
• 1.1.3 MICA 的功能14
• 1.1.4 MICA 與腫瘤的關(guān)系14-15
• 1.2 4-1BBL 概述15-20
• 1.2.1 4-1BBL 的生物學(xué)特性15
• 1.2.2 4-1BBL 分子的表達(dá)15-16
• 1.2.3 4-1BBL/4-1BB 的信號(hào)傳導(dǎo)特性16-17
• 1.2.4 4-1BBL/4-1BB 與免疫細(xì)胞的關(guān)系17-19
• 1.2.5 4-1BBL 與腫瘤細(xì)胞的關(guān)系19-20
• 1.3 立題依據(jù)20-21
• 第2章 hMICA 基因表達(dá)載體的構(gòu)建21-32
• 2.1 材料和方法21-27
• 2.1.1 材料21-23
• 2.1.2 方法23-27
• 2.2 結(jié)果27-31
• 2.3 討論31-32
• 第3章 4-1BBL 基因表達(dá)載體的構(gòu)建/轉(zhuǎn)染及表達(dá)鑒定32-45
• 3.1 材料和方法32-38
• 3.1.1 材料32-34
• 3.1.2 方法34-38
• 3.2 結(jié)果38-42
• 3.2.1 PCR 獲取目的基因38-39
• 3.2.2 PMD18-T-h4-1BBL 克隆的構(gòu)建及鑒定39
• 3.2.3 pVITRO-h4-1BBL 真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定39-41
• 3.2.4 G418 最佳篩選濃度的選擇41
• 3.2.5 陽(yáng)性轉(zhuǎn)染細(xì)胞的鑒定41-42
• 3.3 討論42-45
• 3.3.1 表達(dá)細(xì)胞的選擇43
• 3.3.2 表達(dá)質(zhì)粒的選擇43
• 3.3.3 人工脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的優(yōu)點(diǎn)43-44
• 3.3.4 陽(yáng)性轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選44-45
• 第4章 研究總結(jié)45-46
• 4.1 本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果45
• 4.2 擬進(jìn)一步的研究方案45-46
• 參考文獻(xiàn)46-50
• 致謝50

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前5條

1 孫琳琳;劉利民;孫學(xué)科;周剛;趙金玲;;MIC基因的研究進(jìn)展[J];免疫學(xué)雜志;2006年S1期

2 王群,張利寧,肖東杰,丁培芳,宋靜,孫汶生;人外周血樹突狀細(xì)胞的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)及其表面CD137、CD137L的表達(dá)特點(diǎn)[J];山東大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2003年04期

3 張錦英;居頌文;;CD137L分子在人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549上的表達(dá)及其生物學(xué)功能的研究[J];中國(guó)血液流變學(xué)雜志;2007年03期

4 張彩,馮進(jìn)波,王郡甫,許曉群,張建,田志剛;膜型分泌型MICA對(duì)NK細(xì)胞受體NKG2D的相反調(diào)節(jié)效應(yīng)及其對(duì)NK細(xì)胞受體譜的影響[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;2004年02期

5 齊錦,彭萍,戴夢(mèng)華,李勇海,崔蓮仙,何維;MICA反應(yīng)性Vδ1γδT細(xì)胞對(duì)上皮腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用[J];中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào);2004年01期

  本文關(guān)鍵詞：人4-1BBL在K562細(xì)胞中的表達(dá)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：412937