本文關鍵詞：SPIO及LV-GFP對TSCs標記的有效性和安全性分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景： 肌腱干細胞（TSCs）是來源于肌腱組織的一種具有高度增殖潛能、正常情況下分化為肌腱細胞的一種前體細胞，2007年Bi等首次從兔肌腱內(nèi)分離，并證實TSCs具有成骨、成脂、成軟骨等多向分化潛能，大量研究表明外源性TSCs有可能成為肌腱損傷和肌腱病細胞治療的重要手段。TSCs在體外的生物學行為變化及在體內(nèi)的定植和遷移變化是TSCs相關研究的核心問題之一；有效、安全的標記方法對所移植的TSCs進行示蹤對其相關基礎和臨床研究至關重要。 國外有關TSCs的研究均集中于其分子生物學特性的相關研究，而對于其體內(nèi)移植的示蹤及觀察等臨床應用研究尚無相關報道。目前干細胞標記方法較多，均存在各自的優(yōu)缺點。通過查閱大量文獻，我們發(fā)現(xiàn)，SPIO、LV-GFP標記技術可能適合于TSCs的體內(nèi)外標記示蹤。結(jié)合SPIO可活體、無創(chuàng)示蹤，適用于臨床推廣的優(yōu)點，以及慢病毒（LV，Lentivirus）介導的GFP轉(zhuǎn)染示蹤操作簡便、成本低廉、熒光表達穩(wěn)定的優(yōu)點，本課題擬對SPIO、LV-GFP標記TSCs方法的有效性、安全性進行探討。 目的： 1.在文獻報道基礎上，改進TSCs酶消化法，建立穩(wěn)定高效的TSCs分離、獲取方法； 2.探索SPIO及LV-GFP兩種細胞示蹤標記方法合適的標記條件，分析它們對TSCs標記的有效性和安全性，及其對TSCs生物學特性的影響； 3.觀察上述方法在體內(nèi)標記、示蹤的有效性； 通過本課題研究，擬為TSCs的體內(nèi)外示蹤提供有效和安全的技術方法和理論支持。 方法： 1.在國外文獻報道的基礎上，將傳統(tǒng)酶消化-過濾法予以改進，不過濾而直接種植來分離、培養(yǎng)大鼠TSCs，并利用流式分析、免疫熒光、多向誘導分化等手段對該法獲取的TSCs進行鑒定。 2.采用葡聚糖包裹的SPIO和慢病毒介導的綠色熒光蛋白兩種標記手段對TSCs進行標記，觀察SPIO濃度對TSCs標記有效率、體外標記后MRI檢測效率及其對TSCs的生長曲線的影響； 3.摸索不同MOI值Lv-GFP對TSCs標記的有效率、體外標記傳代衰減情況、檢測其對TSCs干性的影響，選擇合最佳的MOI值。 4.建立大鼠跟腱急性斷裂模型，將示蹤標記的TSCs在損傷部位注射，，于損傷早期（1周）及瘢痕重建后（6周）取材，觀察經(jīng)標記的TSCs在急性跟腱斷裂模型中的遷移、定植情況，證實該示蹤方法的有效性。 結(jié)果： 1.通過我們改進的TSCs酶消化法，一只實驗動物即可獲取4瓶原代細胞，較傳統(tǒng)酶消化-過濾法，該法可多量、更穩(wěn)定的獲取原代細胞；該法提取的TSCs形態(tài)、克隆形成能力及增殖能力符合干細胞特征；Ⅰ型膠原、胚胎表面抗原SSEA4、Oct4表達陽性，Ⅲ型膠原表達陰性；干細胞表面標記物CD90、CD44呈陽性表達；CD34、CD106呈陰性表達；在體外誘導的情況下TSCs具有明確的成脂、成骨和成軟骨分化能力。 2.葡聚糖包裹的SPIO能夠標記TSCs，標記有效率隨SPIO濃度增大而增加，作用濃度達到8ug/ml時標記效率95%，細胞內(nèi)能夠有效觀察到鐵顆粒吞噬，但其對TSCs的增殖影響很大。 3. LV-GFP在體外能夠有效標記TSCs，標記有效率隨感染復數(shù)（MOI值）增加而增加，最佳MOI值為500，熒光強度值不隨體外傳代而減低，對成脂、成骨、成軟骨相關基因無明顯影響。 4.外源性TSCs經(jīng)過LV-GFP標記后，能夠在異體正常肌腱內(nèi)隨肌腱纖維的走行定植，在急性跟腱斷裂模型中定植于斷裂部位及形成的瘢痕中，超過6周仍能有效觀察。 結(jié)論： 1.經(jīng)過我們改進的酶消化法分離、培養(yǎng)大鼠跟腱來源TSCs可靠、有效，能夠更多且穩(wěn)定的獲取TSCs；經(jīng)鑒定，該方法提取的TSCs具有明確的干細胞特性，有多向分化潛能。 2.葡聚糖包裹的SPIO雖然能夠可靠標記大鼠TSCs，但對其增殖能力影響過大，可能不適用于TSCs的標記示蹤，其他劑型的SPIO對TSCs標記特性仍有待進一步研究。 3.慢病毒介導的GFP在體外對TSCs示蹤標記有效可靠，標記有效率不隨長期傳代而降低，對其干性無明確影響，是一種針對TSCs的可靠有效的示蹤標記物。 4.外源性TSCs經(jīng)過LV-GFP標記后，能夠觀察到其大鼠跟腱內(nèi)的定植和遷移，LV-GFP在體內(nèi)也能夠有效標記并示蹤TSCs，對TSCs是一種有效的標記示蹤方法。
【關鍵詞】：肌腱干細胞 SPIO LV-GFP 細胞示蹤
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R329
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 英文摘要7-9
• 中文摘要9-11
• 第一章 前言11-13
• 1.1 研究背景11-12
• 1.2 研究意義12
• 1.3 研究內(nèi)容12
• 1.4 研究方法12-13
• 第二章 大鼠跟腱來源肌腱干細胞分離培養(yǎng)及鑒定13-25
• 2.1 引言13
• 2.2 材料與方法13-18
• 2.3 結(jié)果18-23
• 2.4 討論23-24
• 2.5 小結(jié)24-25
• 第三章 SPIO 對體外 TSCs 標記的有效性及對其生物活性的影響25-38
• 3.1 引言25
• 3.2 材料與方法25-29
• 3.3 實驗結(jié)果29-36
• 3.4 討論36-37
• 3.5 小結(jié)37-38
• 第四章 LV-GFP 對體外 TSCs 標記的有效性及對其生物活性的影響38-50
• 4.1 引言38
• 4.2 材料與方法38-43
• 4.3 實驗結(jié)果43-48
• 4.4 討論48-49
• 4.5 小結(jié)49-50
• 第五章 Lv-GFP 標記 TSCs 在大鼠跟腱修復過程的有效性分析50-59
• 5.1 引言50
• 5.2 材料與方法50-53
• 5.3 實驗結(jié)果53-57
• 5.4 討論57
• 5.5 小結(jié)57-59
• 全文結(jié)論59-60
• 參考文獻60-65
• 文獻綜述65-72
• 參考文獻70-72
• 碩士期間發(fā)表和待發(fā)表的文章72-73
• 致謝73

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

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  本文關鍵詞：SPIO及LV-GFP對TSCs標記的有效性和安全性分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：412360