本文關鍵詞：小鼠和人鼻咽發(fā)育形態(tài)學與免疫組織化學研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：第一部分小鼠和人胚胎鼻咽發(fā)育形態(tài)學比較研究 背景 鼻咽是呼吸道的一部分,位于蝶骨體和枕骨基底部的下方,呈不規(guī)則的立方形。人鼻咽有六壁：前壁、后壁、頂壁、底壁及兩側壁。鼻咽壁的組織結構分為4層：粘膜層、粘膜下層、肌層及外膜。粘膜由上皮及固有膜構成；上皮有清晰的基膜,將上皮與固有膜分開。鼻咽部常見的疾病很多,如慢性咽炎；良性腫瘤如咽部乳頭狀瘤、腺瘤等：惡性腫瘤如鼻咽癌。 迄今為止,對正常鼻咽粘膜的形態(tài)認識尚有許多分歧。例如對鼻咽復層鱗狀上皮的來源,目前主要有2種觀點；1、復層鱗狀上皮在出生的時候已經(jīng)存在,屬于正常的上皮。2、復層鱗狀上皮是在出生后由假復層纖毛柱狀上皮化生形成。造成認識分歧的主要原因是難以獲取珍貴的人體材料。 小鼠是生命科學研究首選的動物模型。研究顯示,鼠類99%的基因與人類相同,其胚胎的發(fā)育過程與人胚胎發(fā)育過程有許多相同之處。而且小鼠妊娠時間短,產(chǎn)量高,可以方便的給胚胎發(fā)育研究工作提供生物材料。 目前,對人胚胎鼻咽部發(fā)育的研究較少,而對小鼠胚胎鼻咽部發(fā)育的研究尚未有報道。本文從發(fā)育及形態(tài)學角度研究人、小鼠胚胎鼻咽解剖學與組織學差異,為鼻咽疾病的研究提供組織學依據(jù)。 材料與方法 收集水囊引產(chǎn)的妊娠E9-28W(周)人正常胎兒鼻咽組織共23例；人胚胎來自合法流產(chǎn),米索針劑(前列腺素類)引產(chǎn)的正常胎兒。根據(jù)孕婦提供末次月經(jīng)時間結合測量胎兒的頂跟徑長度及手足形態(tài),核實胎齡,性別不拘。另取C57BL/6J小鼠妊娠E9.5-19.5D(天)正常胎兒,每個妊娠天取材3例,共33例。小鼠每日下午4-6時交配,第二天早上8時,通過檢查陰栓或精子涂片判斷小鼠是否受精。受精成功后,判斷為種鼠妊娠第一天,即日齡為0.5天。取材實驗標本時,在離體4小時內(nèi),將整個鼻咽部連同軟腭一同切下。胚胎組織用Bouin氏固定液固定,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,4-6μtm連續(xù)切片,H.E染色。從前壁向口咽方向,每隔50微米取一張切片,每張切片的每個壁上各取10個視野(不足10個視野的取全壁),光學顯微鏡下記錄鼻咽的結構,上皮的形態(tài)、厚度,細胞層數(shù)及粘膜下腺體的形態(tài)、出現(xiàn)時間等情況。 結果 人胚胎鼻咽部在E9W時已經(jīng)形成。鼻咽部呈不規(guī)則的立方形,頂后壁呈約120°的弧形；鼻咽部富含皺襞、隱窩及淋巴組織。小鼠胚胎鼻咽部在E15D形成,它是一個接近直線的弧形管腔,未見淋巴組織及隱窩等結構。 人與小鼠胚胎鼻咽部粘膜分化過程相似。鼻咽粘膜的分化具有規(guī)律性,但是不同部位粘膜細胞分化不同步。近側鼻咽部粘膜發(fā)育較早,遠側鼻咽部粘膜發(fā)育較晚。后壁、側壁粘膜發(fā)育較早,頂壁粘膜發(fā)育最晚。但與小鼠胚胎相比,人胚胎的鼻咽部發(fā)育成熟相對較早。人胚胎在發(fā)育到胚胎期的1/4時(E9W),就已經(jīng)形成完整、獨立的鼻咽部。而小鼠胚胎則需要到胚胎發(fā)育期的3/4時(E15D),才形成鼻咽部。小鼠胚胎的鼻咽部假復層纖毛柱狀上皮在出生前才完全分化,而人鼻咽胚胎粘膜在胚胎發(fā)育中期(E21W)時就已經(jīng)基本分化完全。同時,鼻咽部的一些組織發(fā)育也同樣如此,例如粘膜下腺體。人胚胎在E11W時,在粘膜下層已經(jīng)開始分化形成腺體。胚胎發(fā)育至E17W,部分腺體已經(jīng)形成腺泡樣結構,可以清晰的分辨出腺體的類型。E21W以后,大部分腺體已經(jīng)形成成熟腺體結構。而小鼠胚胎在E17.5D時方開始形成腺體。出生前,腺體尚未發(fā)育成熟。 E13-28W,人胚胎鼻咽粘膜存在3種類型上皮：大部分是假復層纖毛柱狀上皮,少量是過渡型上皮和未角化的復層鱗狀上皮。過渡型上皮細胞群主要位于后壁、側壁及頂后壁交界處。復層鱗狀上皮位于前壁。鼻咽部主要有兩種不同類型過渡上皮。兩類上皮在淺層或者深層有不同程度的鱗狀細胞化生現(xiàn)象。過渡上皮所在部位向鼻腔方向,為假復層纖毛柱狀上皮；向口咽方向為復層鱗狀上皮。過渡上皮細胞形態(tài)多樣,存在細胞向基底膜面深入生長現(xiàn)象。小鼠胚胎鼻咽粘膜在E19.5D時全部為假復層纖毛柱狀上皮。人胚胎從E13W開始,在鼻咽部側壁及頂側壁交界處就已經(jīng)出現(xiàn)杯狀細胞存在。小鼠的整個胚胎期,鼻咽部粘膜都未發(fā)現(xiàn)有杯狀細胞存在。 結論 1、人胚胎鼻咽部E21W(中期)已基本發(fā)育完善,小鼠胚胎鼻咽粘膜在出生前才分化完成。與人胚胎鼻咽部發(fā)育相比,小鼠胚胎鼻咽部發(fā)育成熟相對較晚。 2、人與小鼠胚胎鼻咽解剖學和組織學差異明顯,可能導致他們對某些疾病易感性及對疾病的抵抗能力不同。 3、過渡上皮的細胞形態(tài)多樣,存在細胞向基底膜面深入生長及鱗狀化生現(xiàn)象,提示過渡上皮細胞的分化受內(nèi)外胚層分化因素共同調(diào)控,性狀不穩(wěn)定。此外,過渡上皮存在的部位可能是內(nèi)外胚層來源的組織的分界線。 第二部分人胚胎鼻咽發(fā)育nestin表達的免疫組化學研究 背景 目前研究發(fā)現(xiàn),許多組織中都存在多潛能的干細胞。盡管對干細胞的確切定義仍存在很多爭議,但目前普遍認為干細胞是一群具有自我更新能力和多向分化潛能的無性系細胞群體。多能干細胞群體可以穩(wěn)定增殖并保持分化潛能。通過非對稱分裂的方式,干細胞產(chǎn)生一個與親代完全相同的細胞、另一個可以編程為其他細胞類型的細胞。鼻咽粘膜上皮細胞終身不斷自我更新,是依靠干細胞持續(xù)增殖、分化以取代終末分化細胞來完成。同時,鼻咽是人體與外界相通的要道,具有重要的防御、呼吸、吞咽、發(fā)聲共鳴等功能。由于與環(huán)境之間直接接觸,鼻咽部很容易受到致病因子的侵襲。因此,鼻咽粘膜組織經(jīng)常處于微小的損傷過程中。在鼻咽部受到損傷后,干細胞分裂加速,起到促進創(chuàng)傷修復的作用。 研究者們普遍認為在鼻咽部的不同部位存在著一群具有干細胞特征的細胞亞群。通過研究發(fā)現(xiàn),鼻咽部確在一群具有增殖、分化潛能的細胞,但由于鼻咽部解剖學結構和功能復雜,細胞種類繁多,干細胞研究進展緩慢。對如何識別鼻咽部的多潛能的干細胞一直是人們努力探索和研究的難題。目前尚缺乏有效的手段來鑒定鼻咽上皮干細胞,這成為臨床應用干細胞治療鼻咽部疾病的障礙。 目前,發(fā)現(xiàn)和鑒定干細胞的方法主要是通過鑒定細胞是否存在干細胞的特異性標記物。大部分的干細胞的發(fā)現(xiàn)都歸功于標記物的使用。但是,目前尚未有關于正常鼻咽部干細胞特有的標記物的相關報道。Nestin是神經(jīng)干細胞的標記物。同時,在胚胎發(fā)育早期,多種組織也強烈表達nestin。我們課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn),nestin在鼻咽癌組織中高表達。近年來研究發(fā)現(xiàn),組織癌變的過程,常常表達胚胎發(fā)育過程中出現(xiàn)的蛋白,這些蛋白在成熟的組織中表達極少。利用這些蛋白作為腫瘤分子標志物,己被應用到腫瘤的早期診斷以及療效、預后評價。 Nestin可否作為鼻咽部干細胞標記物之一?帶著這一問題我們靶定nestin作為研究目標,研究人胚胎鼻咽發(fā)育過程中nestin表達情況,對鼻咽部發(fā)育過程中的干細胞進行鑒定。初步了解nestin與鼻咽發(fā)育的關系,明確nestin是否可以作為鑒定鼻咽干細胞的標記物及鑒定方法,為胚胎鼻咽發(fā)育的分子水平調(diào)控機制的深入研究提供組織學依據(jù)。 材料與方法 取材E9-28W人胚胎的鼻咽部材料(見第一部分)。用免疫組織化學法檢測人鼻咽部nestin表達情況。免疫組織化學法采用SP法,一抗使用鼠抗人單克隆抗體,抗體稀釋度為1：800。取nestin陽性組織切片,E11W人胚腦組織,作為陽性對照。 結果 E9-28W人胚胎鼻咽粘膜未發(fā)現(xiàn)nestin陽性細胞存在。Nestin陽性細胞存在于粘膜下部分未分化完全的腺體細胞、毛細血管內(nèi)皮細胞及幾乎全部肌肉組織的細胞質(zhì)中。胚胎發(fā)育不同時期,nestin在鼻咽部中的表達呈現(xiàn)動態(tài)變化。El1W時,可檢測到nestin首先在粘膜下肌肉組織及毛細血管內(nèi)皮細胞中呈陽性染色,陽性細胞數(shù)目稀少；隨著肌肉組織的發(fā)育及毛細血管增多,nestin陽性細胞逐漸增多。E13W開始,在粘膜下腺體中檢測到部分腺體細胞呈強陽性染色。E11-28W,幾乎所有肌母細胞nestin染色始終處于強陽性狀態(tài),無明顯減弱。粘膜下腺體在E17W時nestin陽性細胞最多。伴隨著腺體逐漸成熟,腺體干細胞進一步分化,nestin表達逐漸減弱。E21W以后,只有少量nestin陽性的腺體細胞。 結論 1、人胚胎發(fā)育的E17W是鼻咽發(fā)育最旺盛的時期。此時,上皮生長迅速,過渡上皮開始分化為兩類形態(tài)不一的過渡上皮(見第一部分),而腺體中nestin陽性細胞數(shù)量達到高峰。上皮細胞及腺體前體細胞的生長發(fā)育都達到空前活躍。 2、Nestin是人胚胎鼻咽部干細胞的標記物之一。它在人胚胎期鼻咽部的多種組織中表達,與鼻咽的發(fā)生和發(fā)育密切相關。但未能證明nestin與粘膜上皮的發(fā)育相關�？赡芘c取材的時間有關,不能排除在鼻咽發(fā)育的更早的時間有nestin的表達。 第三部分Nestin轉基因小鼠咽喉部增生性變化的研究 背景 Nestin屬于Ⅵ型中間纖維絲蛋白,約220-250kDa。它在胚胎發(fā)育早期過程中,在神經(jīng)外胚層組織強烈表達,隨著組織發(fā)育分化,nestin表達逐漸減少,故以它作為神經(jīng)干細胞的標記物。在胚胎發(fā)育早期,多種組織也強烈表達nestin。在成體組織中,nestin只在部分具有分化潛能的細胞中表達,如在皮膚、心血管再生過程中表達增高。Nestin在多種腫瘤組織中表達增加,蛋白表達量與腫瘤的惡性程度成正相關。 體外研究表明,nestin能增強細胞的增殖和存活能力。Nestin和糖皮質(zhì)激素受體結合后使磷脂酰肌醇3激酶活性增強,通過下游的一系列酶促反應促進神經(jīng)祖細胞進行有絲分裂,使細胞增殖。在永生化的神經(jīng)祖細胞系ST15A細胞中,過表達nestin可以對H202造成的細胞損傷起保護作用。Nestin通過Cdk5/p35信號通路,增強細胞生存能力,抑制凋亡發(fā)生。但也有體外研究發(fā)現(xiàn),nestin與增殖無直接相關。在nestin被siRNA抑制表達之后,培養(yǎng)的成神經(jīng)瘤細胞與星形細胞瘤細胞生長減弱,但細胞ki67的表達并不減少。 同時,nestin在體內(nèi)的確切功能并沒有明確。通過對nestin基因敲除小鼠的研究表明：在nestin+/-基因型的雜合子小鼠中,雖然nestin的表達量大幅減少,但并不引起明顯的小鼠發(fā)育異常。說明nestin的表達量減少,可能并不影響小鼠的發(fā)育和生存。但純合子小鼠,即nestin-/-基因型的小鼠,在胚胎發(fā)育過程中出現(xiàn)神經(jīng)管發(fā)育缺陷并致死。Nestin缺失引起神經(jīng)管細胞大量凋亡,導致凋亡的作用和nestin的細胞骨架功能無關。這說明nestin的存在對維持神經(jīng)干細胞的生存和自我更新是必須的,而缺乏nestin對神經(jīng)干細胞的增殖無影響。正常小鼠中,nestin在神經(jīng)系統(tǒng)外的組織也廣泛表達。但nestin基因敲除小鼠其它器官并未發(fā)現(xiàn)明顯異常�？梢娫趎estin的體內(nèi)功能十分復雜。 目前,尚未有關于nestin過表達的轉基因動物的研究報道。為研究nestin在體內(nèi)的功能,我們建立了nestin轉基因小鼠。本文探討nestin過表達對小鼠咽喉部發(fā)育的影響。 材料與方法 C57BL/6J小鼠來源的F5代的E14.5-19.5D的nestin轉基因小鼠胚胎及F3代約12個月大小的nestin轉基因小鼠,性別不拘。取部分小鼠新鮮組織,提取小鼠DNA后,PCR鑒定小鼠基因型。取材E14.5D、E15.5D、E16.5D、E17.5D、 E18.5D、E19.5D、12M的小鼠咽喉部組織,將小鼠分為實驗組與對照組,實驗組為nestin陽性小鼠,對照組為野生型小鼠。每個年齡的小鼠各3只／組。 將小鼠咽喉部連同周圍的組織一同切下后,用Bouin氏固定液固定(組織脫水、染色等步驟見第一部分)。H.E染色后顯微鏡下觀察比較兩組樣本的咽喉部形態(tài)學發(fā)育差異。同時,免疫組織化學法檢測咽喉部nestin表達。免疫組織化學法采用SP法,組織使用鼠抗人nestin單克隆一抗抗體檢測,4℃孵化過夜,抗體稀釋度為1：800。 結果分析：采用SPSS13.0軟件,實驗組與對照組中咽喉部產(chǎn)生腫物的小鼠數(shù)量的比較采用卡方檢驗。若P0.05,認為二者差別有統(tǒng)計學意義。 結果 Nestin在轉基因小鼠胚胎咽喉部、氣管咽粘膜大部分細胞、及其他器官中表達陽性。轉基因小鼠咽喉部發(fā)育與正常小鼠相比,無明顯不同。但約28%轉基因小鼠咽喉部粘膜形成贅生物。實驗組與對照組所得結果比較,其差別具有統(tǒng)計學意義(P=0.008)。 結論 小鼠體內(nèi)過表達nestin后,引起小鼠咽喉部腫物的發(fā)生。Nestin過表達可能導致小鼠咽喉部粘膜細胞的增殖與凋亡失調(diào)。
【關鍵詞】：人 小鼠 胚胎 鼻咽發(fā)育 人胚胎 鼻咽 Nestin Nestin 轉基因小鼠 咽部 喉部 贅生物
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R322.31
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-22
• 前言22-38
• 參考文獻29-38
• 第一部分 小鼠與人胚胎鼻咽發(fā)育形態(tài)學比較研究38-68
• 引言38
• 1 材料與方法38-43
• 2 實驗結果43-63
• 3 討論63-66
• 4 小結66-67
• 參考文獻67-68
• 第二部分 人胚鼻咽發(fā)育nestin表達的免疫組化學研究68-81
• 引言68
• 1 材料與方法68-70
• 2 實驗結果70-77
• 3 討論77-79
• 4 小結79
• 參考文獻79-81
• 第三部分 Nestin轉基因小鼠咽喉部增生性變化的研究81-91
• 引言81
• 1 材料與方法81-85
• 2 實驗結果85-88
• 3 討論88-89
• 4 小結89
• 參考文獻89-91
• 全文小結91-92
• 成果92-93
• 致謝93-94

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1 周毅,王景周,周萍,王昌銘;人臍血單個核細胞中Nestin陽性細胞表達及其臨床意義[J];第三軍醫(yī)大學學報;2005年08期

2 李伊為,崔曉軍,陳東風,杜少輝,黎暉,周建洪;龜板對脊髓損傷大鼠神經(jīng)干細胞的作用[J];神經(jīng)解剖學雜志;2003年03期

3 李艷華,白慈賢,謝超,陳琳,裴雪濤;成人骨髓間充質(zhì)干細胞體外定向誘導分化為胰島樣細胞團的研究[J];自然科學進展;2003年06期

4 周立兵,阮奕文,姚志彬;秋水仙素對大鼠基底前腦Nestin陽性神經(jīng)元的影響[J];解剖科學進展;2003年02期

5 顧懷宇,姚志彬,袁群芳;成人海馬內(nèi)Nestin免疫陽性細胞的分布[J];神經(jīng)解剖學雜志;2002年02期

6 汪建民,阮奕文,姚志彬;巢蛋白在成年大鼠海馬神經(jīng)元的表達及巢蛋白陽性神經(jīng)元的生后發(fā)育[J];神經(jīng)解剖學雜志;2000年04期

7 徐曦,肖新莉,羅秀成,楊世照,李保利,劉勇;永久性腦缺血神經(jīng)干細胞遷移及nestin蛋白表達的變化[J];細胞與分子免疫學雜志;2002年05期

8 周政,陳惠孫,張可成,楊輝;腦創(chuàng)傷后NGF對神經(jīng)干細胞Nestin蛋白表達的影響[J];中華神經(jīng)外科疾病研究雜志;2003年03期

9 周曉琳,趙永波,段淑榮,王勛,張璇;腦梗死后康復訓練對成年大鼠海馬結構中神經(jīng)干細胞的影響[J];神經(jīng)疾病與精神衛(wèi)生;2004年06期

10 劉迎慶;原林;戴景興;修賀明;;視網(wǎng)膜干細胞Nestin在生后大鼠發(fā)育不同階段的表達變化[J];中國臨床解剖學雜志;2006年06期

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1 鄭修元;李勝活;燕鐵斌;劉慧華;向云;莊志強;彭源;;神經(jīng)肌肉電刺激對急性腦梗死大鼠神經(jīng)功能恢復及梗死側皮質(zhì)nestin蛋白表達的影響[A];中國康復醫(yī)學會第七次全國康復治療學術會議主題報告、學術交流論文匯編[C];2010年

2 肖華亮;卞修武;蔣雪峰;王清良;林俐;李增鵬;;Nestin免疫染色在神經(jīng)上皮腫瘤病理診斷中的應用價值[A];中華醫(yī)學會病理學分會2010年學術年會日程及論文匯編[C];2010年

3 李革飛;李劍平;;應用流式細胞術檢測神經(jīng)干細胞表面標志物-Nestin[A];中國輸血協(xié)會第五屆輸血大會論文專集（摘要篇）[C];2010年

4 馬睿杰;林咸明;陳曉軍;;電項針對大鼠腦缺血再灌注損傷后NCAM和Nestin表達的影響[A];2011中國針灸學會年會論文集（摘要）[C];2011年

5 宋萌;時素華;姚海江;余仁峰;鄭光華;李志剛;;電針對大鼠脊髓損傷后Nestin表達的實驗研究[A];中國針灸學會第九屆全國中青年針灸推拿學術研討會論文集[C];2010年

6 王樹興;袁群芳;姚志彬;;穹隆海馬傘切斷對大鼠基底前腦nestin陽性神經(jīng)元的影響[A];解剖學雜志——中國解剖學會2002年年會文摘匯編[C];2002年

7 穗喜祥;程文佳;劉寧;黃惠存;張西民;王映梅;楊守京;;CD133和Nestin在乳腺癌中表達和意義[A];中華醫(yī)學會病理學分會2009年學術年會論文匯編[C];2009年

8 張玉春;王樹興;阮奕文;姚志彬;;大鼠基底前腦nestin陽性神經(jīng)元有別于GABA能神經(jīng)元[A];解剖學雜志——中國解剖學會2002年年會文摘匯編[C];2002年

9 王樹興;顧懷宇;姚志彬;;Nestin免疫陽性神經(jīng)元在人和恒河猴基底前腦的分布和化學性質(zhì)[A];解剖學雜志——中國解剖學會2002年年會文摘匯編[C];2002年

10 徐延豪;李花;沈雪莉;石玉秀;;培養(yǎng)脊髓神經(jīng)干細胞nestin表達與免疫電鏡觀察[A];全面建設小康社會：中國科技工作者的歷史責任——中國科協(xié)2003年學術年會論文集（下）[C];2003年

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1 本報記者 謝明霞;從蛋白質(zhì)組學入手 探究鼻咽癌[N];健康報;2011年

2 記者 胡德榮;人胚胎早期器官形成由誰調(diào)控[N];健康報;2010年

3 德;日本有條件允許治療性克隆人胚胎研究[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2004年

4 張孟軍;美用人胚胎育出17個干細胞系[N];科技日報;2004年

5 張?zhí)锟?“人獸雜交”胚胎的技術和倫理突破[N];東方早報;2007年

6 ;單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂誘導成年大鼠骨髓基質(zhì)細胞成為神經(jīng)前體細胞及其分化作用的研究[N];中國醫(yī)藥報;2003年

7 吳一福;我國脊髓神經(jīng)損傷治療邁上新臺階[N];中國醫(yī)藥報;2007年

8 張荔子;中國倫理視角：治療性克隆應當允許[N];健康報;2006年

9 劉浩然 曹津燕 高翔 甘榮興 提供;人類干細胞研究的發(fā)展與倫理[N];中國知識產(chǎn)權報;2006年

10 王軍;人植入后全胚胎體外培養(yǎng)首獲成功[N];中國中醫(yī)藥報;2003年

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 李振林;巢蛋白過表達轉基因小鼠的建立及巢蛋白過表達對肝臟增殖的影響[D];南方醫(yī)科大學;2012年

2 趙珞;IGF-1R選擇性誘導敲除對Nestin~+骨髓間充質(zhì)干細胞遷移和分化的影響[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2013年

3 田井琦;大鼠胰島和胰腺干細胞的體外分離和培養(yǎng)[D];吉林大學;2004年

4 劉鵬

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