本文關鍵詞：hBMP-2基因修飾的BMSCs促進BMSCs向成骨細胞分化的實驗研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的 1.體外分離培養(yǎng)及擴增純化骨髓間充質干細胞(Bone Mesenchymal Stem Cells, BMSCs),為骨組織工程提供種子細胞。 2.通過轉基因技術,建立穩(wěn)定表達骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(Bone Morphogenetic Protein-2, BMP-2)的BMSCs細胞株。 3.檢測hBMP-2基因修飾的BMSCs對BMSCs向成骨細胞分化的影響。 方法 1.取1-2個月的雜種幼犬,脛骨抽取骨髓3-4mL,全骨髓貼壁法進行分離培養(yǎng)及擴增純化,觀察其形態(tài)。利用成骨誘導液培養(yǎng)第3代的BMSCs,分別采用免疫細胞化學法、微量酶標法及茜素紅染色檢測骨鈣素(Bone Gla Proteins, BGP)、堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase, ALP)的表達情況及鈣結節(jié)的形成情況。利用成軟骨誘導液誘導第3代BMSCs細胞團塊,用HE染色及甲苯胺藍染色檢測軟骨生成的情況。 2.取第3代的BMSCs,用慢病毒介導的hBMP-2基因進行轉染。通過熒光顯微鏡觀察轉染后綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)表達情況,檢測轉染效率。通過RT-PCR和免疫細胞化學分別檢測hBMP-2mRNA及其蛋白表達情況。MTT及流式細胞檢測轉染前后BMSCs生長增殖能力。Transwell細胞遷移實驗檢測慢病毒介導的hBMP-2轉染對BMSCs遷移能力的影響。 3.相同實驗條件下通過transwell系統(tǒng)共培養(yǎng),對比hBMP-2轉染的BMSCs與空病毒轉染及未轉染的BMSCs對共培養(yǎng)的BMSCs的促成骨分化作用,分別采用免疫細胞化學法、微量酶標法及熒光定量PCR檢測BGP、ALP及Ⅰ型膠原(type Ⅰ collagen, COLL Ⅰ) mRNA的表達情況,茜素紅染色檢測鈣結節(jié)的生成情況。 結果 1.原代BMSCs貼壁呈集落式生長,8-10天后BMSCs鋪滿瓶底70%-80%,傳代后細胞呈長梭形,漩渦狀排列,形態(tài)典型、均一,有較強的生長增殖能力。ALP檢測結果顯示ALP隨誘導天數(shù)增加而表達增多,與對照組有顯著差異(P0.05),免疫細胞化學結果顯示成骨誘導后BGP呈強陽性,表達顯著高于對照組(P0.05),BMSCs茜素紅染色可見陽性表現(xiàn)的鈣結節(jié)。說明分離培養(yǎng)的BMSCs可定向分化成成骨細胞。成軟骨誘導后的BMSCs細胞團塊行HE染色可觀察到典型的軟骨組織形態(tài),行甲苯胺藍染色可見軟骨基質形成異染性的紫紅,說明分離培養(yǎng)的BMSCs可定向向軟骨細胞分化。 2.慢病毒介導的hBMP-2成功轉染犬BMSCs,轉染效率可達70%-80%；RT-PCR可檢測到轉染后hBMP-2mRNA的表達；免疫細胞化學可檢測到轉染后BMP-2蛋白的陽性表達。MTT檢測生長曲線結果顯示轉染前后BMSCs生長增殖情況無明顯改變,流式法測細胞周期結果顯示轉染前后細胞周期無明顯改變,細胞轉染后仍有較強的生長增殖能力；transwell細胞遷移實驗結果顯示轉染后hBMP-2基因組BMSCs的遷移數(shù)量明顯增多(P0.05),說明BMP-2轉染可增強BMSCs的運動遷移能力。 3.共培養(yǎng)后hBMP-2基因轉染組的BMSCs的免疫細胞化學結果BGP呈陽性,茜素紅染色鈣結節(jié)呈陽性,ALP表達增多,熒光定量PCR法檢測Ⅰ型膠原mRNA表達水平增高,與未轉染組及空載病毒組比較均有顯著差異(P＜0.05),因此慢病毒介導hBMP-2基因轉染BMSCs表達分泌的BMP2可誘導BMSCs向成骨細胞分化。 結論 1.全骨髓貼壁法簡單、易行,可成功培養(yǎng)、擴增出大量純化的犬BMSCs,能為骨組織工程提供足夠的種子細胞。并且所獲細胞可成功向成骨及成軟骨方向誘導分化。 2.慢病毒介導的hBMP-2可成功、高效的轉染犬BMSCs,并可穩(wěn)定表達hBMP-2mRNA及其蛋白。 3.慢病毒介導的hBMP-2轉染對細胞生長增殖無明顯影響,且可增強BMSCs的遷移運動能力。 4. Transwell共培養(yǎng)可簡單模擬體內(nèi)微環(huán)境,且轉基因BMSCs表達分泌的BMP2可誘導BMSCs向成骨細胞分化。
【關鍵詞】：慢病毒載體 骨髓間充質干細胞 人骨形成蛋白2 共培養(yǎng) 成骨
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R329
【目錄】：

• 英文縮略語對照5-7
• 摘要7-10
• ABSTRACT10-14
• 前言14-18
• 論文正文18-68
• 試驗一：犬骨髓間充質干細胞的分離培養(yǎng)及鑒定18-35
• 1 材料及器械18-20
• 2 試驗方法20-24
• 3 結果24-31
• 4 討論31-35
• 實驗二：慢病毒介導的hBMP-2基因轉染對犬骨髓間充質細胞生物學性狀的影響35-55
• 1 材料與器械35-37
• 2 實驗方法37-43
• 3 結果43-52
• 4 討論52-55
• 實驗三：hBMP-2基因修飾的BMSCs促進BMSCs向成骨細胞分化的實驗研究55-68
• 1 材料與器械56-57
• 2 實驗方法57-60
• 3 結果60-65
• 4 討論65-68
• 結論68
• 參考文獻68-75
• 二、文獻綜述75-87
• 參考文獻82-87
• 三、致謝87-88
• 四、攻讀碩士學位期間所發(fā)表的論文88

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前7條

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本文編號：403982